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thendlee金蟲 (正式寫手)
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[求助]
虛心請教關于平—粘末端的連接問題
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用sal I和sca I這兩個酶處理過目的片段和載體，純化回收后連接，轉化后板沒有菌落，不知道哪里出現了問題。 這兩個酶，處理后一個產生粘性末端，一個產生平末端，有人說這樣的按正常的連接體系條件就可以，但我一直沒有成功。 我在做的是構建全長，最后的這個1800bp的片段怎么也加不進去。 關于目的片段：是PCR產物，純化處理過，測序正確。 關于載體：確定有這兩個酶切位點，并且唯一。 關于T4連接酶：分別用過TAKARA、NEB、以及Fermentas。 關于連接體系：調整過多次比例。 關于反應溫度：試過16度過夜、22度4小時等等。 關于抗性：這個還是不會弄錯的。 關于感受態(tài)：自己做的，商品化的都用過 [ Last edited by thendlee on 2012-3-12 at 19:34 ] |
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2樓2012-03-12 19:55:54
thendlee
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preciousun
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【答案】應助回帖
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thendlee(金幣+2): ★有幫助, 我一個是粘性 一個是平端 為什么自連呢？再說自連也應該長菌啊，可板上什么都沒。。。 2012-03-14 19:54:13
感謝參與，應助指數 +1
thendlee(金幣+2): ★有幫助, 我一個是粘性 一個是平端 為什么自連呢？再說自連也應該長菌啊，可板上什么都沒。。。 2012-03-14 19:54:13
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樓主你好! 是這樣的, 一般平末端連接效率很低的, 更何況1.8kb已經是比較大的片段了! 有幾個建議: 1.根據載體的分子量, 嚴格控制載體: 目的片段的mol=1:1, 16度連接過夜 2.切開的載體去磷酸化,防止自體連接 3. 先連接到T載體上, 再選用T載體和你的目的載體上都有而目的片段上沒有的粘性末端內切酶同時酶切T和目的載體, 連接 或者 選用目的載體上別的內切酶; 重新換引物PCR目的片段 |
5樓2012-03-14 09:22:45
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