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liuwei0824新蟲 (初入文壇)
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[求助]
關(guān)于平末端連接 已有3人參與
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大家好！我最近在做平末端連接的實(shí)驗，總是做不成功，求教~~ 載體是用smal1酶切的平末端，片段是雙酶切的粘性末端，酶切后，載體進(jìn)行去磷酸化，片段進(jìn)行末端補(bǔ)平，然后進(jìn)行連接反應(yīng)（16℃過夜），然后轉(zhuǎn)化，平板上都不長菌。。。。 一開始載體是在30度酶切2h，片段在37度酶切2h，跑電泳后發(fā)現(xiàn)，載體只是部分被切開了，然后酶切時間就改成了過夜，結(jié)果都切沒了，，， 所有的酶都用的是Takara公司的。 求高人指點(diǎn)�。。�！謝謝啦O(∩_∩)O~ |
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【答案】應(yīng)助回帖
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4樓說得很有道理！ 你沒有搞懂平末端化的原理就剛做這種“非主流”的克隆，勇氣可嘉。 Klenow Fragment說到底是個DNA polymerase，相當(dāng)于引物擴(kuò)增，只能從5’-3‘方向進(jìn)行。 大部分常用的限制性內(nèi)切酶都是5'突出的，也就是縮進(jìn)去的那個free的是3’末端，這樣就可以補(bǔ)平 但是對于3‘突出的限制性內(nèi)切酶，縮進(jìn)去的是5’末端，這個就不能繼續(xù)用Klenow Fragment的正向反應(yīng)了。 解決之道很簡單，就是Klenow Fragment還有一個3‘-5’的核酸外切酶活性，就是不加dNTP，可以把5‘突出的切平。 專業(yè)干這活的是T4 DNA polymerase，活性比Klenow Fragment高很多，但是我一直就用Klenow也行。 我喜歡在切片之后再加點(diǎn)dNTP讓它補(bǔ)平，因為切到平齊的時候?qū)嶋H上進(jìn)行的是一個交換反應(yīng)。 但是，如果你說酶切過夜，載體就沒了，這個相當(dāng)不正常。 |
6樓2014-03-25 19:43:13
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2樓2012-12-18 12:23:31
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8樓2016-01-15 10:39:14
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10樓2016-01-15 18:08:06
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