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thendlee金蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
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[求助]
虛心請(qǐng)教關(guān)于平—粘末端的連接問(wèn)題
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用sal I和sca I這兩個(gè)酶處理過(guò)目的片段和載體，純化回收后連接，轉(zhuǎn)化后板沒(méi)有菌落，不知道哪里出現(xiàn)了問(wèn)題。 這兩個(gè)酶，處理后一個(gè)產(chǎn)生粘性末端，一個(gè)產(chǎn)生平末端，有人說(shuō)這樣的按正常的連接體系條件就可以，但我一直沒(méi)有成功。 我在做的是構(gòu)建全長(zhǎng)，最后的這個(gè)1800bp的片段怎么也加不進(jìn)去。 關(guān)于目的片段：是PCR產(chǎn)物，純化處理過(guò)，測(cè)序正確。 關(guān)于載體：確定有這兩個(gè)酶切位點(diǎn)，并且唯一。 關(guān)于T4連接酶：分別用過(guò)TAKARA、NEB、以及Fermentas。 關(guān)于連接體系：調(diào)整過(guò)多次比例。 關(guān)于反應(yīng)溫度：試過(guò)16度過(guò)夜、22度4小時(shí)等等。 關(guān)于抗性：這個(gè)還是不會(huì)弄錯(cuò)的。 關(guān)于感受態(tài)：自己做的，商品化的都用過(guò) [ Last edited by thendlee on 2012-3-12 at 19:34 ] |
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