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thendlee金蟲 (正式寫手)
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[求助]
虛心請教關(guān)于平—粘末端的連接問題
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用sal I和sca I這兩個酶處理過目的片段和載體，純化回收后連接，轉(zhuǎn)化后板沒有菌落，不知道哪里出現(xiàn)了問題。 這兩個酶，處理后一個產(chǎn)生粘性末端，一個產(chǎn)生平末端，有人說這樣的按正常的連接體系條件就可以，但我一直沒有成功。 我在做的是構(gòu)建全長，最后的這個1800bp的片段怎么也加不進(jìn)去。 關(guān)于目的片段：是PCR產(chǎn)物，純化處理過，測序正確。 關(guān)于載體：確定有這兩個酶切位點，并且唯一。 關(guān)于T4連接酶：分別用過TAKARA、NEB、以及Fermentas。 關(guān)于連接體系：調(diào)整過多次比例。 關(guān)于反應(yīng)溫度：試過16度過夜、22度4小時等等。 關(guān)于抗性：這個還是不會弄錯的。 關(guān)于感受態(tài)：自己做的，商品化的都用過 [ Last edited by thendlee on 2012-3-12 at 19:34 ] |
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thendlee
金蟲 (正式寫手)
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【答案】應(yīng)助回帖
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thendlee(金幣+2): ★有幫助, 我一個是粘性 一個是平端 為什么自連呢？再說自連也應(yīng)該長菌啊，可板上什么都沒。。。 2012-03-14 19:54:13
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thendlee(金幣+2): ★有幫助, 我一個是粘性 一個是平端 為什么自連呢？再說自連也應(yīng)該長菌啊，可板上什么都沒。。。 2012-03-14 19:54:13
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樓主你好! 是這樣的, 一般平末端連接效率很低的, 更何況1.8kb已經(jīng)是比較大的片段了! 有幾個建議: 1.根據(jù)載體的分子量, 嚴(yán)格控制載體: 目的片段的mol=1:1, 16度連接過夜 2.切開的載體去磷酸化,防止自體連接 3. 先連接到T載體上, 再選用T載體和你的目的載體上都有而目的片段上沒有的粘性末端內(nèi)切酶同時酶切T和目的載體, 連接 或者 選用目的載體上別的內(nèi)切酶; 重新?lián)Q引物PCR目的片段 |
5樓2012-03-14 09:22:45
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