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thendlee金蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
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[求助]
虛心請(qǐng)教關(guān)于平—粘末端的連接問(wèn)題
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用sal I和sca I這兩個(gè)酶處理過(guò)目的片段和載體，純化回收后連接，轉(zhuǎn)化后板沒(méi)有菌落，不知道哪里出現(xiàn)了問(wèn)題。 這兩個(gè)酶，處理后一個(gè)產(chǎn)生粘性末端，一個(gè)產(chǎn)生平末端，有人說(shuō)這樣的按正常的連接體系條件就可以，但我一直沒(méi)有成功。 我在做的是構(gòu)建全長(zhǎng)，最后的這個(gè)1800bp的片段怎么也加不進(jìn)去。 關(guān)于目的片段：是PCR產(chǎn)物，純化處理過(guò)，測(cè)序正確。 關(guān)于載體：確定有這兩個(gè)酶切位點(diǎn)，并且唯一。 關(guān)于T4連接酶：分別用過(guò)TAKARA、NEB、以及Fermentas。 關(guān)于連接體系：調(diào)整過(guò)多次比例。 關(guān)于反應(yīng)溫度：試過(guò)16度過(guò)夜、22度4小時(shí)等等。 關(guān)于抗性：這個(gè)還是不會(huì)弄錯(cuò)的。 關(guān)于感受態(tài)：自己做的，商品化的都用過(guò) [ Last edited by thendlee on 2012-3-12 at 19:34 ] |
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2樓2012-03-12 19:55:54
thendlee
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thendlee(金幣+2): ★有幫助, 我一個(gè)是粘性 一個(gè)是平端 為什么自連呢？再說(shuō)自連也應(yīng)該長(zhǎng)菌啊，可板上什么都沒(méi)。。。 2012-03-14 19:54:13
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thendlee(金幣+2): ★有幫助, 我一個(gè)是粘性 一個(gè)是平端 為什么自連呢？再說(shuō)自連也應(yīng)該長(zhǎng)菌啊，可板上什么都沒(méi)。。。 2012-03-14 19:54:13
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樓主你好! 是這樣的, 一般平末端連接效率很低的, 更何況1.8kb已經(jīng)是比較大的片段了! 有幾個(gè)建議: 1.根據(jù)載體的分子量, 嚴(yán)格控制載體: 目的片段的mol=1:1, 16度連接過(guò)夜 2.切開(kāi)的載體去磷酸化,防止自體連接 3. 先連接到T載體上, 再選用T載體和你的目的載體上都有而目的片段上沒(méi)有的粘性末端內(nèi)切酶同時(shí)酶切T和目的載體, 連接 或者 選用目的載體上別的內(nèi)切酶; 重新?lián)Q引物PCR目的片段 |
5樓2012-03-14 09:22:45
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7樓2012-03-14 17:43:51
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thendlee: 金幣+1, ★有幫助, 嗯，謝謝你~其實(shí)我的目的片段現(xiàn)在已經(jīng)連到T載體了 可是從T載體上切下來(lái)不還還要用到salI-ScaI? 2012-03-16 15:46:10
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
thendlee: 金幣+1, ★有幫助, 嗯，謝謝你~其實(shí)我的目的片段現(xiàn)在已經(jīng)連到T載體了 可是從T載體上切下來(lái)不還還要用到salI-ScaI? 2012-03-16 15:46:10
| 根據(jù)你的描述 sal I 和sac I 應(yīng)該在目地片段的首和尾，你的片段測(cè)序正確的，酶切pcr產(chǎn)物如果不好做，我建議在片段兩端加上重組臂，重新擴(kuò)pcr，先裝入puc57或puc18常用載體。等測(cè)序?qū)α恕Ｔ谟眉恿酥亟M臂的首尾擴(kuò)質(zhì)粒。載體用sal 1切 直接做重組。 |
8樓2012-03-14 20:46:57
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