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【求助】求藥物研究國家自然科學基金標書
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求藥物研究國家自然科學基金標書 [ Last edited by book2005593 on 2010-12-4 at 20:21 ] |
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好教授(金幣+10):謝謝 2010-12-15 20:23:04
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中標2005年國家自然科學基金 2005國家自然科學基金標書1 題目L0108神經細胞保護作用機理 （一）立項依據與研究內容（4000-8000字）： 1、 項目的立項依據（附主要的參考文獻目錄）。 隨著經濟的發(fā)展和生活水平的不斷提高，我國人口平均壽命也在不斷延長，老年人口的增多，60歲以上人口已占總人口的10%以上，達到1.34億，而且每年以3%的速度增加。以神經系統(tǒng)疾病為主要特征的老年性疾病已經成為嚴重威脅老齡人群生活質量的重要原因，并且直接增加了家庭和社會負擔。 神經退行性疾病是老年人的常見病，在我國僅老年癡呆發(fā)病人數(shù)就超過300萬，而且隨著年齡的增加，發(fā)病率也在提高；腦血管疾病是老年人群中發(fā)病率、致殘率和死亡率均很高的疾病，嚴重威脅著老年人的生命，影響生活質量。這些疾病均以神經細胞的損傷為主要病變特征，因此，尋找具有神經保護作用的藥物，對于防治神經細胞損傷引起的疾病具有重要意義。 目前臨床應用的神經細胞損傷保護藥物如鈣通道阻滯劑（尼莫地平）；自由基清除劑（生育酚、SOD）；神經營養(yǎng)因子 （神經生長因子、神經營養(yǎng)因子）；***A拮抗劑 ；神經節(jié)苷酯和興奮性氨基酸受體拮抗劑等等。這些藥物雖然可以通過不同的途徑發(fā)揮保護神經細胞功能的作用，但治療效果仍然不能滿足臨床需要，研究新型保護神經細胞功能的藥物，仍然是藥學研究的重要課題。 Pinocembrin (左旋Pinocembrin， DL0108) 是從番荔枝科（Annonaceae）哥納香屬（Goniothalamus）植物中分離得到的黃酮類化合物，現(xiàn)發(fā)現(xiàn)該化合物存在于多種其他植物中，在蜂蜜中也含有該物質，并認為該化合物是這些天然產物發(fā)揮治療和保健作用的活性成分之一。早期的藥理實驗研究表明，DL0108沒有明顯的毒副作用，對多種致病菌有顯著的抑菌活性，能夠提高機體抗氧化能力，對腫瘤細胞也具有一定的抑制作用，該化合物以及其他衍生物具有擴張血管作用。本實驗室研究證明，結構與DL0108類似的黃酮類化合物多數(shù)具有抑制細菌生長作用和擴張血管作用，但作用強弱不同。而在神經細胞的保護作用方面，目前還沒有文獻報道。 本實驗室通過對數(shù)百中黃酮類化合物的比較研究證明， DL0108（左旋Pinocembrin）除具有良好的擴張血管、改善腦血流的作用外，具有很強的神經細胞保護作用，對實驗性腦缺血引起的腦組織損傷具有良好的保護作用，可以縮小腦組織梗死面積，改善腦缺血動物的行為學障礙，促進腦缺血動物的腦功能恢復。初步作用機理研究表明，DL0108對腦缺血損傷的保護作用不僅依賴于腦血流的改善，而且通過其他多種途徑發(fā)揮神經細胞功能保護作用。詳細研究結果見工作基礎部分。經專利查新證明，DL0108對神經細胞的作用目前尚未報道，研究結果正在申請專利保護（已經完成專利文書撰寫，正在申報）。 根據現(xiàn)有實驗資料分析，DL0108對神經細胞功能的保護作用可能與多種途徑有關，深入認識該化合物的作用和作用機理，對于發(fā)現(xiàn)新型的腦保護藥物具有重要的理論意義和應用價值，而且對于闡明多種含有DL0108化合物的天然產物臨床作用基礎，具有重要的參考價值。本項目將在已有的實驗基礎上，對DL0108進行作用機理研究，闡明其神經細胞功能保護作用的機制和特點，為開發(fā)具有治療價值的藥物提供實驗證據。 主要參考文獻： 1. Biondi DM, Rocco C, Ruberto G. New dihydrostilbene derivatives from the leaves of Glycyrrhiza glabra and evaluation of their antioxidant activity. J Nat Prod. 2003;66(4):477-80. 2. Fahey JW, Stephenson KK. Pinostrobin from honey and Thai ginger (Boesenbergia pandurata): a potent flavonoid inducer of mammalian phase 2 chemoprotective and antioxidant enzymes. J Agric Food Chem. 2002;50(25):7472-6. 3. Rossi A, Ligresti A, Longo R, Russo A, Borrelli F, Sautebin L. The inhibitory effect of propolis and caffeic acid phenethyl ester on cyclooxygenase activity in J774 macrophages. Phytomedicine. 2002;9:530-5. 4. Zhou L, Guo J, Yu J. Flavonoids from Beijing propolis. 中國中藥雜志. 1999;24(3):162-4, 191. 5. Martos I, Ferreres F, Yao L, D'Arcy B, Caffin N, Tomas-Barberan FA. Flavonoids in monospecific eucalyptus honeys from Australia. J Agric Food Chem. 2000;48(10):4744-8. 6. Bosio K, Avanzini C, D'Avolio A, Ozino O, Savoia D. In vitro activity of propolis against Streptococcus pyogenes. Lett Appl Microbiol. 2000;31(2):174-7. 7. Hegazi AG, Abd El Hady FK, Abd Allah FA. Chemical composition and antimicrobial activity of European propolis. Z Naturforsch [C]. 2000;55(1-2):70-5. 8. Bremner PD, Meyer JJ. Pinocembrin chalcone: an antibacterial compound from Helichrysum trilineatum. Planta Med. 1998;64:777. 9. Santos AC, Uyemura SA, Lopes JL, Bazon JN, Mingatto FE, Curti C. Effect of naturally occurring flavonoids on lipid peroxidation and membrane permeability transition in mitochondria. Free Radic Biol Med. 1998;24(9):1455-61. 10. Habtemariam S. Flavonoids as inhibitors or enhancers of the cytotoxicity of tumor necrosis factor-alpha in L-929 tumor cells. J Nat Prod. 1997;60:775-8. 11. Del Rayo Camacho M, Sanchez B, Quiroz H, Contreras JL, Mata R. Pinocembrine: a bioactive flavanone from Teloxys graveolens. J Ethnopharmacol. 1991;31(3):383-9. |
2樓2010-12-15 13:29:17
好教授(金幣+10):謝謝 2010-12-15 20:23:16
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2005國家自然科學基金標書2 2、 項目的研究內容、研究目標,以及擬解決的關鍵問題。 1) 項目的研究內容 本項目將在已有研究的基礎上，主要研究DL0108保護神經細胞功能的作用機理和作用靶點，同時通過多種黃酮類化合物的比較，闡明DL0108的作用特點。目前的實驗結果顯示，該化合物表現(xiàn)出多方面的作用，突出的特點是神經細胞功能的保護作用，為了能夠準確認識其作用機理，本研究將通過對相關的主要作用途徑進行綜合探討和比較，達到最終闡明其作用特點和機制的目的。研究內容包括： ①、對興奮性氨基酸毒性的作用。 應用谷氨酸引起神經細胞損傷的模型，研究DL0108對興奮性氨基酸毒性的影響；通過對興奮性氨基酸受體和受體介導的信號轉導作用的研究，探討該化合物影響興奮性氨基酸毒性的作用機制； ②、對氧化應激、低氧低糖導致神經細胞損傷的保護作用。 低氧低糖，缺氧復氧以及過氧化反應都與氧代謝過程的紊亂有關，參與的機制除機體抗氧化能力外，與氧的代謝過程也有密切的關系，特別是線粒體功能的變化，直接影響著細胞的損傷、壞死、凋亡。此外，NO的產生和代謝也參與了神經細胞損傷過程，通過對DL0108抗氧化作用、線粒體功能保護等作用的研究，證明其保護神經細胞的抗氧化機制。 腦耐受的特征是誘導細胞內多種特殊基因表達(如c-fos、c-jun、鋅指基因)，從無到有合成或增加相關應激蛋白(如Fos蛋白、熱休克蛋白 HSP)，而正常蛋白質的合成則受到抑制或停止。熱休克蛋白(heat shock proteins, HSP)是多種應激蛋白的總稱, 如HSP27、HSP47、HSP70、HSP90等，分子量在7～200 KD之間。研究化合物對其表達的影響，是認識腦保護作用重要內容。 同時探討DL0108對神經選擇性易損神經元的作用。 ③、對離子代謝紊亂和鈣超載引起的細胞損傷的保護作用。 細胞內鈣離子超載是導致細胞損傷的重要原因之一，糾正細胞的離子代謝紊亂是保護神經細胞功能重要措施,離子代謝紊亂是復雜的過程，特別與離子通道的功能關系密切，前期研究證明，DL0108對神經小膠質細胞的鈉-氫交換有明顯的影響，對細胞內鈣的升高具有調節(jié)作用。在此基礎上，利用膜片鉗技術和其他技術研究該化合物對離子代謝的影響,可以有利于認識其作用機理； Calpain激活所致的蛋白分解是全腦缺血的一個潛在的病理過程, Calpain誘導的蛋白分解在缺血損傷后很快即出現(xiàn),遠遠早于病理上可檢測到的梗死形成。由于Calpain是一種鈣激活的蛋白酶，其激活程度與胞漿游離鈣水平呈正相關，Calpain被激活，導致蛋白水解增加，很可能是神經元易損的原因之一。DL0108對Calpain活性的影響將作為研究的內容之一。 ④、β-淀粉樣蛋白等因素引起神經細胞損傷的保護作用和作用機理。 淀粉樣蛋白沉積是導致神經退行性病變的重要原因之一，特別是在老年癡呆（AD）病的發(fā)病過程中，與Tau蛋白磷酸化、神經纖維纏結有密切關系，認識DL0108在保護神經細胞過程中對這些損傷因素的影響機制，有利于全面評價化合物的藥理作用。 ⑤動物病理模型的綜合評價。 根據以上研究結果，通過作用機理分析，選用適當動物模型觀察DL0108的作用和作用特點，可供選擇的動物模型如：腦缺血動物模型、老年鼠動物模型、β-淀粉樣蛋白致癡呆動物模型以及其他動物模型。 通過對DL0108在以上不同途徑中的作用進行綜合分析比較研究，探討該化合物在生理和病理條件下對細胞代謝、線粒體功能、信號轉導、神經因子相互作用等方面的影響，闡明DL0108對病理條件下保護神經細胞的途徑和靶點，提高對該化合物的理論認識。在以上研究的基礎上，采用動物實驗對其藥理作用進行驗證，全面評價其在神經退行性疾病、神經損傷性疾病中的保護作用，奠定研發(fā)治療神經退行性疾病和神經損傷性疾病的藥物提供理論和實驗依據。 2）項目的研究目標： 根據已經積累的研究結果，經過全面分析，通過以上內容的研究，達到以下目標： ①通過以上內容的研究，基本闡明DL0108神經細胞功能保護作用的靶點、機理、和特點；通過實驗對其作用和應用前景進行全面評價，為臨床應用提供實驗依據和理論資料；為治療神經退行性和神經細胞損傷性疾病提供實驗資料。 ②通過比較研究，探討黃酮類化合物在神經保護方面的作用特點和結構特點，闡明DL0108作用的結構（包括手性結構特點）基礎；探討不同神經細胞損傷因素在神經退行性疾病和神經細胞損傷性疾病中作用地位，尋找針對不同因素和綜合因素的治療藥物。 ③通過動物實驗，觀察多靶點相互作用對神經退行性疾病的治療效果，全面評價DL0108對不同動物模型的作用。 3) 擬解決的關鍵問題： （1） 神經退行性疾病細胞模型的評價和DL0108作用機理分析。本項目采用多種方法，從多方面對神經細胞功能的變化進行研究和分析，采用綜合指標評價多因素對細胞功能的影響，探討目標化合物的作用特點，確定優(yōu)先指標和模型是研究的關鍵問題之一。 （2） DL0108作用的結構基礎和作用靶點的判定是認識該化合物作用關鍵，也是評價其作用的基礎，通過分析多靶點和多途徑的綜合效果，是完成研究內容實現(xiàn)研究目的的關鍵環(huán)節(jié)。 （3） 研究神經退行性病變和細胞損傷因素之間的關系，在評價藥物作用和治療效果方面具有重要意義。 （4） 建立適合研究內容和研究目的的動物病理模型，是評價損傷因素的地位和藥物作用的關鍵內容，在現(xiàn)有的基礎上，利用研究的結果進行整體動物模型的驗證，是非常必要和重要的措施。 3.擬采取的研究方案及可行性分析。 本項目將按照以下方案完成研究內容： 在已有工作基礎上，采用分子生物學和分子藥理學方法，針對性地選擇可能的分子靶點建立體外分析模型，評價DL0108的作用和作用機理；采用細胞生物學方法，建立適當?shù)纳窠浖毎麚p傷模型，選用具有針對性的檢測指標，評價DL0108的作用和作用特點；綜合以上研究結果，判斷該化合物的作用靶點和作用特點；在綜合分析的基礎上，對該化合物的作用機理進行驗證和研究；最后根據作用機理研究結果，選用和建立適當?shù)膭游锬Ｐ�，進一步評價DL0108的作用和機理。 ①、對相關分子靶點的作用研究 主要研究DL0108對以下靶點的作用：興奮性氨基酸***A受體，離子通道和鈉氫交換體，過氧化反應和自由基生成，NO 合酶活性，β-淀粉樣蛋白毒性以及Tau蛋白磷酸化等，通過以上研究，證明DL0108的基本作用機理。腦耐受相關的多種特殊基因表達(如c-fos、c-jun、鋅指基因)，和相關應激蛋白(如Fos蛋白、熱休克蛋白heat shock proteins, HSP)的表達。 可行性分析：以上靶點的分析研究是本實驗室進行高通量藥物篩選的基本技術和模型，除個別需要探索后建立檢測方法外，多數(shù)方法已經或正在使用中，具備開展工作的基本條件和技術條件，方法穩(wěn)定、技術成熟。 ②、細胞生物學方法和細胞病理模型的建立和應用。 神經細胞（細胞系及原代培養(yǎng)神經細胞）的增殖實驗；多種因素誘導的神經細胞損傷細胞模型，如興奮性氨基酸（谷氨酸），氧化應激（H2O2等），低氧低糖，β-淀粉樣蛋白毒性，鈣超載等，觀察神經細胞損傷后細胞形態(tài)、細胞功能（包括線粒體功能）、細胞因子表達、細胞內鈣、細胞凋亡、Calpain激活等變化；觀察化合物的保護作用。同時探討DL0108對神經選擇性易損神經元的作用。 可行性分析：本實驗室具有完善的分子生物學和細胞生物學實驗條件，上述細胞模型多數(shù)已經在長期的工作中建立并應用，部分模型需要對實驗條件優(yōu)化；在細胞培養(yǎng)和結果檢測方面，具有配套的實驗設備和技術力量。完全可以在規(guī)定時間內完成研究內容。 ③、綜合評價和作用機理分析 針對以上實驗獲得的結果，對DL0108化合物的作用進行綜合分析，主要探討起作用的選擇性、特異性、作用強度，分析各種指標之間的相互關系，通過分析，判斷該化合物可能的作用途徑和作用靶點。在綜合分析的基礎上，采用分子生物學方法和細胞生物學方法，對確定的主要（可能是多靶點和多途徑）機理進行深入研究，達到對其作用效果的多方面評價。 可行性分析：本課題組參加人員具有博士學位和博士研究生多名，在神經藥理學研究中具有較好的理論基礎，可以完成結果分析任務；深入研究的技術也已經具備，可以保證完成上述工作。 ④、動物病理模型的綜合評價。 根據以上研究結果，通過作用機理分析，選用適當動物模型觀察DL0108的作用和作用特點，可供選擇的動物模型如：腦缺血動物模型、老年鼠動物模型、β-淀粉樣蛋白致癡呆動物模型以及其他動物模型。 可行性分析：在多年的工作中，本實驗室已經具備了制備多種神經退行性病變動物模型，并采用多因素方法，制備了動物神經細胞線粒體功能障礙的癡呆動物模型和實驗性老年癡呆動物模型。具備實驗的條件和技術。 ⑤綜合分析和課題總結。 通過最后的分析，全面評價其在神經退行性疾病、神經損傷性疾病中的保護作用，確定DL0108的作用機理，配合新藥開發(fā)研究的結果，為該化合物的臨床應用提供實驗依據�？偨Y資料，進行課題驗收和總結，提供研究報告和文章。 3、 本項目的特色與創(chuàng)新之處。 1） 前期研究工作已經取得比較肯定結果，在已有基礎上，針對具有良好藥理作用的化合物DL0108進行系統(tǒng)的基礎研究，有利于深入認識該化合物的作用機理，奠定新藥研究的理論基礎。 2） 在已有工作基礎上，利用已經建立的高通量篩選技術，結合神經退行性疾病的特點，進行多靶點多途徑的研究，實現(xiàn)藥物研究的綜合評價，對新藥研究方法和技術有一定創(chuàng)新。 3） 該化合物的神經保護作用為新發(fā)現(xiàn)的用途，而且作用具有明顯的特點，特別是在抑制鈉氫交換體的作用和對多種活性物質表達的影響，有可能成為作用機理新穎的腦保護藥物。 4、 年度研究計劃及預期研究結果。（2005.1～2007.12） 預計在三年內完成項目研究內容： 2005年1月——2005年12月，采用高通量體外研究技術，完成對DL0108多靶點的研究工作，同時進行同類化合物的比較，確定該化合物的作用機理和作用特點。特別是在現(xiàn)有基礎上，對相關的新靶點進行研究，確定該化合物的研究主要方向。對該新用途獲得專利保護（目前已經申報專利）�？偨Y資料發(fā)表論文2篇。 2006年1月——2006年12月，針對相關的作用機理，建立能夠反映細胞損傷和功能變化的神經細胞模型，采用多種能夠相互驗證和相互補充的細胞病理模型，證明DL0108的藥理作用，通過與其他不同類型的比較，進一步確定該化合物的作用效果�？偨Y資料發(fā)表論文3篇。 2007年1月——2007年12月，建立與DL0108作用機理相關的神經細胞（腦細胞）功能損傷動物模型，并結合現(xiàn)有神經損傷模型和神經退行性疾病模型，觀察該化合物的整體作用，為新藥研究奠定理論和實驗基礎。工作總結，項目驗收。總結資料發(fā)表論文3篇。 |
3樓2010-12-15 13:30:04
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SIIA8樓
2012-02-16 20:25
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