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北京石油化工學(xué)院2026年研究生招生接收調(diào)劑公告
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xwsooo

銀蟲 (小有名氣)


[交流] 【求助/交流】HRM技術(shù)的幾個(gè)問題

我搜索了些HRM的資料看,現(xiàn)在還有些不明白的地方:
1。溶解曲線的差異是根據(jù)堿基含量的不同,那么就要求個(gè)樣品的DNA含量一致才不會(huì)影響結(jié)果,我提取的是外周血DNA,那么如何保證DNA含量的一致呢?
2。對(duì)于一對(duì)引物,需不需要要求T m值差異要大些?引物是不是和普通PCR 的引物一樣呢?
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lovenlong

銅蟲 (小有名氣)


我做HRM的幾點(diǎn)認(rèn)識(shí)!

★ ★ ★ ★
lstt09nk(金幣+4):辛苦~~歡迎常來生物版交流 2010-12-16 00:00:15
xwsooo(金幣+1):灰常感謝 2010-12-16 08:10:21
1.要保證PCR體系的一致性,把相同的反應(yīng)物混合后分裝,最后加有差異的成分(一般是DNA或引物),稍微甩一下,上面滴點(diǎn)礦物油(Mineral Oil,SIGMA M5904).
2.DNA用量不要太多(10微升一般10~30ng),定量稀釋差不多同一個(gè)濃度就可以了。一般你提的方法很仔細(xì)的話,濃度都挺高的,那稀釋個(gè)幾十到幾百倍那純度也很高了。
3.特異性的問題:引物Tm值稍微高點(diǎn)比較好,我一般23nt以上的引物跑的;用好點(diǎn)的酶,最好是HotStart的,我用TAKARA的Taq Hotstart Version (250U,RMB 350)效果不錯(cuò),反應(yīng)體系也不用怎么優(yōu)化的。
4.關(guān)于熒光染料,推薦用EvaGreen(1ml RMB 400),LC green 太貴(1ml RMB 1400~1700),其實(shí)好像沒什么差別的,而且用10微升的體系0.8微升就夠了。染料會(huì)使引物Tm值上升一點(diǎn)點(diǎn)。
5.擴(kuò)增片段的GC 含量要注意,如果GC比較高,那HRM分析的溫度區(qū)域可能很高,一般不要超過95度~
我有一個(gè)單堿基差異的兩份水稻材料,目前測(cè)試的結(jié)果分辨率還不錯(cuò),接下來就是大規(guī)模掃描的應(yīng)用了。有需要這兩個(gè)DNA來測(cè)試的蟲友可以一起交流交流~本人廣州華南農(nóng)業(yè)大學(xué)的~
8樓2010-12-15 20:26:33
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普通回帖
看暈我了,沒看明白你的意思
2樓2010-12-15 16:22:36
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xwsooo

銀蟲 (小有名氣)


引用回帖:
Originally posted by silicare at 2010-12-15 16:22:36:
看暈我了,沒看明白你的意思

不好意思,我現(xiàn)在先自我解釋一下 ,首先HRM技術(shù)的精確性受到不同標(biāo)本中DNA濃度的影響,所以必須先保證DNA 濃度的一致,方法有,用紫外分光光度計(jì)測(cè)量吸光度,用TE稀釋至1.0.
第二,與兩條引物的tm差應(yīng)該無關(guān)吧。但我還不明白的是HRM需不需要設(shè)計(jì)特異性引物,有別于普通PCR引物設(shè)計(jì)的那種??/
最后都說HRM成本低,那我想了解如果做500份標(biāo)本,那么大概要花多少RMB?
3樓2010-12-15 17:03:02
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引用回帖:
Originally posted by xwsooo at 2010-12-15 16:13:25:

我提取的是外周血DNA,那么如何保證DNA含量的一致呢?
  

上邊這句話啥意思
4樓2010-12-15 17:09:29
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hfkset

銅蟲 (初入文壇)


★ ★ ★
xwsooo(金幣+1):灰常感謝 2010-12-15 18:28:59
rainwander(金幣+3):哈哈啊,差不多就這樣,染料是挺貴的..... 2010-12-15 18:38:11
HRM要求DNA濃度一樣,但也不用太精確,跑膠看著差不多就行,引物和普通PCR引物一樣,不用特殊的。至于成本,染料比較貴,1000ul,1300RMB
5樓2010-12-15 17:19:46
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xwsooo

銀蟲 (小有名氣)


rainwander:賣這個(gè)儀器的地,有賣染料的,你問問~~ 2010-12-15 18:38:51
引用回帖:
Originally posted by hfkset at 2010-12-15 17:19:46:
HRM要求DNA濃度一樣,但也不用太精確,跑膠看著差不多就行,引物和普通PCR引物一樣,不用特殊的。至于成本,染料比較貴,1000ul,1300RMB

不知道這染料1000微升是什么意思,能做多少份標(biāo)本呢 ?
6樓2010-12-15 18:30:50
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xwsooo

銀蟲 (小有名氣)


還有一個(gè)問題,HRM的內(nèi)參怎么加,因?yàn)?一管只能檢測(cè)一個(gè)產(chǎn)物,那么內(nèi)參得在另外一管,那這樣的也算是內(nèi)參嗎?
7樓2010-12-15 18:47:21
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lovenlong

銅蟲 (小有名氣)


引用回帖:
Originally posted by xwsooo at 2010-12-15 18:47:21:
還有一個(gè)問題,HRM的內(nèi)參怎么加,因?yàn)?一管只能檢測(cè)一個(gè)產(chǎn)物,那么內(nèi)參得在另外一管,那這樣的也算是內(nèi)參嗎?

樓上兄弟是否做定量的?定量不是很懂,看你是相對(duì)還是絕對(duì)定量吧?!
好像HRM不需要內(nèi)參。。。
9樓2010-12-15 20:28:30
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hfkset

銅蟲 (初入文壇)


xwsooo(金幣+1): 2010-12-17 17:21:40
引用回帖:
Originally posted by xwsooo at 2010-12-15 18:30:50:


不知道這染料1000微升是什么意思,能做多少份標(biāo)本呢 ?

我買的是1管1000ul的包裝,15ul PCR體系,1-2ul染料
10樓2010-12-17 13:24:51
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xwsooo

銀蟲 (小有名氣)


引用回帖:
Originally posted by hfkset at 2010-12-17 13:24:51:

我買的是1管1000ul的包裝,15ul PCR體系,1-2ul染料

不知道您用過roche 的480儀器做過么,效果好么
11樓2010-12-17 17:23:42
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sutao1979

木蟲 (著名寫手)


xwsooo(金幣+1):灰常感謝 2010-12-18 09:47:28
引用回帖:
Originally posted by xwsooo at 2010-12-15 16:13:25:
我搜索了些HRM的資料看,現(xiàn)在還有些不明白的地方:
1。溶解曲線的差異是根據(jù)堿基含量的不同,那么就要求個(gè)樣品的DNA含量一致才不會(huì)影響結(jié)果,我提取的是外周血DNA,那么如何保證DNA含量的一致呢?
2。對(duì)于一對(duì)引物 ...

你說的應(yīng)該是SNP差異分析吧,用HRM系列的qpcr機(jī)器確實(shí)可以分辨,原理是根據(jù)melting curve的差異來分辨單個(gè)堿基的變化。但是,分辨差異并不需要DNA含量完全一致,如果一致也就是通常的spectrophotometre測(cè)就可以了,然后換算一下;引物沒有特殊要求,保證沒有dimer,crossing dimer就ok了,不然有干擾。
12樓2010-12-18 00:49:47
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xwsooo

銀蟲 (小有名氣)


引用回帖:
Originally posted by sutao1979 at 2010-12-18 00:49:47:


你說的應(yīng)該是SNP差異分析吧,用HRM系列的qpcr機(jī)器確實(shí)可以分辨,原理是根據(jù)melting curve的差異來分辨單個(gè)堿基的變化。但是,分辨差異并不需要DNA含量完全一致,如果一致也就是通常的spectrophotometre測(cè)就可 ...

我又突然想起一個(gè)問題,HRM分辨的是不同鏈中堿基含量的變化,如果擴(kuò)增的片斷里含有多個(gè)SNP位點(diǎn)呢?我怎么鑒定我所需要的SNP的基因型呢???
13樓2010-12-18 22:48:44
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kidluag

金蟲 (正式寫手)


學(xué)習(xí)中
14樓2012-06-07 03:25:26
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歐朵拉

鐵蟲 (小有名氣)



小木蟲: 金幣+0.5, 給個(gè)紅包,謝謝回帖
引用回帖:
952781樓: Originally posted by lovenlong at 2010-12-15 20:26:33
1.要保證PCR體系的一致性,把相同的反應(yīng)物混合后分裝,最后加有差異的成分(一般是DNA或引物),稍微甩一下,上面滴點(diǎn)礦物油(Mineral Oil,SIGMA M5904).
2.DNA用量不要太多(10微升一般10~30ng),定量稀釋差不多 ...

我剛做HRM實(shí)驗(yàn),也遇到樓主一樣的困惑。想請(qǐng)教一下,模板的質(zhì)量對(duì)PCR的影響大嗎?一般如何保證模板的一致性?你的PCR體系是如何優(yōu)化的?
15樓2012-12-17 23:07:16
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歐朵拉

鐵蟲 (小有名氣)



小木蟲: 金幣+0.5, 給個(gè)紅包,謝謝回帖
引用回帖:
944645樓: Originally posted by hfkset at 2010-12-15 17:19:46
HRM要求DNA濃度一樣,但也不用太精確,跑膠看著差不多就行,引物和普通PCR引物一樣,不用特殊的。至于成本,染料比較貴,1000ul,1300RMB

DNA的濃度有怎樣的要求,是在一個(gè)數(shù)量級(jí)上就可以嗎?
16樓2012-12-17 23:09:32
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歐朵拉

鐵蟲 (小有名氣)


引用回帖:
1036106樓: Originally posted by sutao1979 at 2010-12-18 00:49:47
你說的應(yīng)該是SNP差異分析吧,用HRM系列的qpcr機(jī)器確實(shí)可以分辨,原理是根據(jù)melting curve的差異來分辨單個(gè)堿基的變化。但是,分辨差異并不需要DNA含量完全一致,如果一致也就是通常的spectrophotometre測(cè)就可以 ...

弱弱的請(qǐng)教一下:我現(xiàn)在用HRM作SNP分型,除了模板不同,體系都一樣,模板根據(jù)紫外分光光度計(jì)測(cè)OD然后稀釋到相同的濃度,可是分型出現(xiàn)了好多組(正常的應(yīng)該3組),不知道是什么原因,是模板的質(zhì)量引起的嗎?還有,做HRM實(shí)驗(yàn)的PCR體系如何優(yōu)化?現(xiàn)在很茫然···
17樓2012-12-17 23:13:50
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kidluag

金蟲 (正式寫手)



小木蟲: 金幣+0.5, 給個(gè)紅包,謝謝回帖
我是搞突變體庫的,想要找一個(gè)有HRM LightScanner或者其他相關(guān)儀器的地方對(duì)我已經(jīng)PCR的產(chǎn)物進(jìn)行分析,當(dāng)然可以付費(fèi)分析的,不知道樓主知不知道這類地方,樓主您那有沒有相關(guān)儀器可以付費(fèi)使用的呢?
18樓2013-01-30 14:42:39
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kidluag

金蟲 (正式寫手)


我是搞突變體庫的,想要找一個(gè)有HRM LightScanner或者其他相關(guān)儀器的地方對(duì)我已經(jīng)PCR的產(chǎn)物進(jìn)行分析,當(dāng)然可以付費(fèi)分析的,不知道樓主知不知道這類地方,樓主您那有沒有相關(guān)儀器可以付費(fèi)使用的呢?拜托大俠了
19樓2013-01-30 14:49:08
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渭水凡夫

鐵蟲 (小有名氣)



小木蟲: 金幣+0.5, 給個(gè)紅包,謝謝回帖
引用回帖:
6樓: Originally posted by xwsooo at 2010-12-15 18:30:50
不知道這染料1000微升是什么意思,能做多少份標(biāo)本呢 ?...

每個(gè)樣只需加0.2ul  1k3的染料 估計(jì)是LCgreen    樣多的話  推薦用KIT  帶染料  比較劃算
20樓2013-12-04 23:24:47
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misszwh

銀蟲 (小有名氣)



小木蟲: 金幣+0.5, 給個(gè)紅包,謝謝回帖
引用回帖:
13樓: Originally posted by xwsooo at 2010-12-18 22:48:44
我又突然想起一個(gè)問題,HRM分辨的是不同鏈中堿基含量的變化,如果擴(kuò)增的片斷里含有多個(gè)SNP位點(diǎn)呢?我怎么鑒定我所需要的SNP的基因型呢???...

我們一般做單個(gè)SNP位點(diǎn)。如果2個(gè)也可以,主要根據(jù)堿基間結(jié)合能力的強(qiáng)弱,結(jié)合強(qiáng)的TM值高,結(jié)合弱的TM值低。
21樓2014-02-25 22:50:16
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misszwh

銀蟲 (小有名氣)


引用回帖:
16樓: Originally posted by 歐朵拉 at 2012-12-17 23:09:32
DNA的濃度有怎樣的要求,是在一個(gè)數(shù)量級(jí)上就可以嗎?...

我們都是稀釋到同一個(gè)濃度。
22樓2014-02-25 22:50:52
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xrxleisure

銅蟲 (正式寫手)



小木蟲: 金幣+0.5, 給個(gè)紅包,謝謝回帖
引用回帖:
8樓: Originally posted by lovenlong at 2010-12-15 20:26:33
1.要保證PCR體系的一致性,把相同的反應(yīng)物混合后分裝,最后加有差異的成分(一般是DNA或引物),稍微甩一下,上面滴點(diǎn)礦物油(Mineral Oil,SIGMA M5904).
2.DNA用量不要太多(10微升一般10~30ng),定量稀釋差不多 ...

你做HRM PCR的時(shí)候樣品做復(fù)孔嗎?
23樓2015-08-17 14:59:45
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xrxleisure

銅蟲 (正式寫手)



小木蟲: 金幣+0.5, 給個(gè)紅包,謝謝回帖
引用回帖:
6樓: Originally posted by xwsooo at 2010-12-15 18:30:50
不知道這染料1000微升是什么意思,能做多少份標(biāo)本呢 ?...

如果你要配10uL的反應(yīng)體系的話,一個(gè)樣品只需5uL染料。
24樓2015-08-17 15:01:56
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