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xwsooo

銀蟲 (小有名氣)

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[交流] 【求助/交流】HRM技術(shù)的幾個(gè)問題

我搜索了些HRM的資料看,現(xiàn)在還有些不明白的地方:
1。溶解曲線的差異是根據(jù)堿基含量的不同，那么就要求個(gè)樣品的DNA含量一致才不會(huì)影響結(jié)果，我提取的是外周血DNA，那么如何保證DNA含量的一致呢？
2。對(duì)于一對(duì)引物，需不需要要求T m值差異要大些？引物是不是和普通PCR 的引物一樣呢？

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1樓 2010-12-15 16:13:25

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lovenlong

銅蟲 (小有名氣)

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我做HRM的幾點(diǎn)認(rèn)識(shí)！

★ ★ ★ ★
lstt09nk(金幣+4):辛苦~~歡迎常來生物版交流 2010-12-16 00:00:15
xwsooo(金幣+1):灰常感謝 2010-12-16 08:10:21

1.要保證PCR體系的一致性，把相同的反應(yīng)物混合后分裝，最后加有差異的成分（一般是DNA或引物），稍微甩一下，上面滴點(diǎn)礦物油（Mineral Oil,SIGMA M5904）.
2.DNA用量不要太多（10微升一般10~30ng），定量稀釋差不多同一個(gè)濃度就可以了。一般你提的方法很仔細(xì)的話，濃度都挺高的，那稀釋個(gè)幾十到幾百倍那純度也很高了。
3.特異性的問題：引物Tm值稍微高點(diǎn)比較好，我一般23nt以上的引物跑的；用好點(diǎn)的酶，最好是HotStart的，我用TAKARA的Taq Hotstart Version (250U,RMB 350)效果不錯(cuò)，反應(yīng)體系也不用怎么優(yōu)化的。
4.關(guān)于熒光染料，推薦用EvaGreen(1ml RMB 400),LC green 太貴（1ml RMB 1400~1700）,其實(shí)好像沒什么差別的，而且用10微升的體系0.8微升就夠了。染料會(huì)使引物Tm值上升一點(diǎn)點(diǎn)。
5.擴(kuò)增片段的GC 含量要注意，如果GC比較高，那HRM分析的溫度區(qū)域可能很高，一般不要超過95度~
我有一個(gè)單堿基差異的兩份水稻材料，目前測(cè)試的結(jié)果分辨率還不錯(cuò)，接下來就是大規(guī)模掃描的應(yīng)用了。有需要這兩個(gè)DNA來測(cè)試的蟲友可以一起交流交流~本人廣州華南農(nóng)業(yè)大學(xué)的~

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8樓2010-12-15 20:26:33

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silicare

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看暈我了，沒看明白你的意思

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2樓2010-12-15 16:22:36

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引用回帖:

Originally posted by silicare at 2010-12-15 16:22:36:
看暈我了，沒看明白你的意思

不好意思，我現(xiàn)在先自我解釋一下，首先HRM技術(shù)的精確性受到不同標(biāo)本中DNA濃度的影響，所以必須先保證DNA 濃度的一致，方法有，用紫外分光光度計(jì)測(cè)量吸光度，用TE稀釋至1.0.
第二，與兩條引物的tm差應(yīng)該無關(guān)吧。但我還不明白的是HRM需不需要設(shè)計(jì)特異性引物，有別于普通PCR引物設(shè)計(jì)的那種？？/
最后都說HRM成本低，那我想了解如果做500份標(biāo)本，那么大概要花多少RMB?

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3樓2010-12-15 17:03:02

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引用回帖:

Originally posted by xwsooo at 2010-12-15 16:13:25:

我提取的是外周血DNA，那么如何保證DNA含量的一致呢？

上邊這句話啥意思

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4樓2010-12-15 17:09:29

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