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zwb2010jn木蟲 (小有名氣)
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[交流]
【求助/交流】求助重疊PCR的問題，有哪位高手能幫忙看看，不勝感激！ 已有1人參與
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引物 5'-3' 1 GGAATTCAACTAGCTCTGCAATGACCT （EcoRI） 2 GTCGATAATGTGATTCCATGACGTTGC （斜體為互補序列） 3 GCAACGTCATGGAATCACATTATCGAC （斜體為互補序列） 4 ACGCGTCGACTCAAGTTCTAGAATTAA (SalI) ldh基因上游片段大小為518bp，下游片段為498bp 方法1、PCRmix 反應(yīng)液 10µL 雙蒸水：7µL 上下游引物各: 1 µL ATCC13870的模板DNA 1 µL 加入Taq DNA聚合酶0.2µL�；旌虾筮M行PCR反應(yīng) (94℃ 60 s，57℃ 50 s，72℃ 120 s)，經(jīng)過30個循環(huán)后 再72℃延伸10 min。 方法2、上游片段A：518 bp；下游片段B：498 bp 然后：25微升體系（A：1µL，B：1µL，雙蒸水：10µL，5U/µL Tap聚合酶：0.2µL，PCR Mix：13µL） 然后：95度，4min， 94度，55s 56度，40s 72度，1min 5個循環(huán)。 72度，2min 然后在72度，2min的過程中就再加入25微升補充體系，（引物1：1µL，引物4：1µL，雙蒸水：10µL，5U/µL Tap聚合酶：0.2µL，PCR Mix：13µL ） 混合成50微升體系 95度，4min， 94度，50s 56度，40s 72度，1min 30個循環(huán)。 72度，10min 重疊PCR的結(jié)果照片上傳了 |
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Arrennew
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2樓2010-12-31 20:56:37
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