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[交流] 【求助/交流】質(zhì)粒構(gòu)建步驟，回答的好，還有幾十金幣追加�。。�！

跪求S100A16-GST 質(zhì)粒構(gòu)建步驟，酶切位點(diǎn)EcoRⅠ和NheⅠ兩個。各位蟲友幫幫忙啊，老板急著要，實(shí)驗(yàn)室沒人做這個....百感交集！�。。。�

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1樓 2011-01-05 13:43:02

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feng__

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rainwander(金幣+1):鼓勵積極參與~~~ 2011-01-05 14:05:59

載體和片段都用那2個酶進(jìn)行酶切，回收后連接，轉(zhuǎn)化，挑克隆，鑒定，木了

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2樓2011-01-05 13:50:23

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feilr

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sc_truth(金幣+1):雖然沒有解釋清楚我想要的，但是還是非常感激！ 2011-01-05 16:06:44

推薦給你一個軟件，說不定能夠幫上你進(jìn)行設(shè)計，NoeClone,你可以在網(wǎng)上搜索下載的，然后設(shè)計目的基因的引物，PCR目的基因，雙酶切目的基因和載體，膠回收，連接片段，轉(zhuǎn)化細(xì)胞，鑒定質(zhì)粒，電泳初檢測，測序目的片段，在做實(shí)驗(yàn)之前最好搞清楚連接或者酶切會出錯不，比如移位，位點(diǎn)插反等等

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3樓2011-01-05 14:03:49

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gongeleven

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4樓2011-01-05 15:07:12

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sc_truth

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引用回帖:

Originally posted by sc_truth at 2011-01-05 13:43:02:
跪求S100A16-GST 質(zhì)粒構(gòu)建步驟，酶切位點(diǎn)EcoRⅠ和NheⅠ兩個。各位蟲友幫幫忙啊，老板急著要，實(shí)驗(yàn)室沒人做這個....百感交集�。。。�！

謝謝指點(diǎn)，能否再請您給一份詳細(xì)步驟。因?yàn)槭切率郑驹砬宄�，但是不會具體實(shí)驗(yàn)操作！不勝感激�。�！

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5樓2011-01-05 16:03:09

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scienzyme

鐵桿木蟲 (著名寫手)

詳細(xì)步驟你得看分子克隆、分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南之類的書。要自己摸索了。

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6樓2011-01-05 16:17:54

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DH5a

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amisking(金幣+2):鼓勵交流！ 2011-01-05 20:27:30

用一個酶切完之后，溶液回收，再用另一個酶切，膠回收，目的片段也是用同樣的方法，然后按載體片段與目的片段1:3，酶聯(lián)。轉(zhuǎn)化，找陽性克隆。送測序

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7樓2011-01-05 20:03:03

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lxj341401

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rainwander(金幣+1):《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》可是大全啊~~~鼓勵積極參與~~~ 2011-01-07 21:20:32

看看《分子克隆》吧，說的再詳細(xì)也沒上面詳細(xì)呀！

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8樓2011-01-05 22:47:58

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silicare(金幣+1):多看看文獻(xiàn)，網(wǎng)友提供的步驟你敢用嗎？ 2011-01-07 08:22:04

引用回帖:

Originally posted by lxj341401 at 2011-01-05 22:47:58:
看看《分子克隆》吧，說的再詳細(xì)也沒上面詳細(xì)呀！

但是上面只講了原理呀，沒有具體步驟哦，我想找份步驟借鑒借鑒。各位如果有的話，發(fā)至郵箱sc_truth@126.com，必有重謝！！！

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9樓2011-01-07 00:12:16

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sc_truth

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rainwander:不是的啊，《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》主要講的是方法步驟啊~~~ 2011-01-07 21:20:08

引用回帖:

Originally posted by DH5a at 2011-01-05 20:03:03:
用一個酶切完之后，溶液回收，再用另一個酶切，膠回收，目的片段也是用同樣的方法，然后按載體片段與目的片段1:3，酶聯(lián)。轉(zhuǎn)化，找陽性克隆。送測序

但是上面只講了原理呀，沒有具體步驟哦，我想找份步驟借鑒借鑒。各位如果有的話，發(fā)至郵箱sc_truth@126.com，必有重謝�。�！

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10樓2011-01-07 00:12:32

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lxj341401

至尊木蟲 (著名寫手)

引用回帖:

Originally posted by sc_truth at 2011-01-07 00:12:16:

但是上面只講了原理呀，沒有具體步驟哦，我想找份步驟借鑒借鑒。各位如果有的話，發(fā)至郵箱sc_truth@126.com，必有重謝！��！

分子克隆上原理其實(shí)講的少，主要是各個實(shí)驗(yàn)步驟了.

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11樓2011-01-07 07:51:05

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alexguo221

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sc_truth(金幣+2):大致過程清楚了。我拿到的質(zhì)粒用的是EcoRⅠ和NheⅠ兩個酶切位點(diǎn)，但是NheⅠ畢竟不常用，所以要重新PCR一次。但是我僅知道這多，請教一下，下面的步驟，大致要怎么設(shè)計呢？ 2011-01-07 15:44:16

載體和目的片段都用這兩個酶，酶切。2h左右。然后跑一個low melt膠。割膠回收，取樣做連接。室溫放置幾個小時。然后再轉(zhuǎn)化。最后挑取菌落，培養(yǎng)，鑒定。

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12樓2011-01-07 12:56:24

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sc_truth(金幣+6):非常感激，先學(xué)著，不懂的，再請教各位師兄師姐！感激不盡！ 2011-01-08 00:03:52

如果你覺得NheⅠ不常用的話，你也可以用點(diǎn)EcoRⅠ單酶切。
載體用EcoRⅠ單酶切后，在low melt上跑出，割膠回收。再用去磷酸化酶處理，防止自連。
然后你的pcr產(chǎn)物，跑出后，割膠回收，可以先直接與T載體（比如pcr2.1）相連。然后轉(zhuǎn)到感受態(tài)里面，涂板。
挑取菌落，培養(yǎng)，做個小題質(zhì)粒，用EcoRⅠ酶切，跑膠，割膠回收。這個過程就可以把目的基因切了下來，并且是EcoRⅠ粘性末端。
最后你就可以拿預(yù)先處理好的載體和切下來的基因做連接。轉(zhuǎn)化，涂板。
用EcoRⅠ單酶切，相比你那個雙酶切，劣勢是，可能會出現(xiàn)假陽性。
不用菌落長的多的話肯定會有真的。一半一半。

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13樓2011-01-07 23:17:39

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陳曦晨曦晨曦14樓

2012-03-12 16:40 回復(fù)

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