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【求助】請(qǐng)問(wèn)雜質(zhì)HPLC檢查時(shí)，如何確定檢測(cè)波長(zhǎng)
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2樓2011-02-16 16:46:00
mrzouhao
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4樓2011-02-16 17:03:19
7樓2011-02-16 17:08:45
sunnybluesea(金幣+20): 很好 謝謝 2011-02-21 13:01:43
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轉(zhuǎn)貼以下內(nèi)容供LZ參考： http://www.med66.com/html/ziliao ... 8c1fc3bf14d65d9.htm 關(guān)于HPLC主成分自身對(duì)照法檢查有關(guān)物質(zhì)時(shí)檢測(cè)波長(zhǎng)確定的討論 【臨床藥學(xué)討論版】 關(guān)于HPLC主成分自身對(duì)照法檢查有關(guān)物質(zhì)時(shí)檢測(cè)波長(zhǎng)確定的討論審評(píng)二部張玉琥 有 關(guān)物質(zhì)檢查，包括對(duì)產(chǎn)品中殘留合成原料、中間體、副產(chǎn)物及可能的降解產(chǎn)物的檢查 ，是控制藥品質(zhì)量的重要指標(biāo)，目的是檢查藥品中所含的上述雜質(zhì)是否符合安全性的 要求 ,同時(shí)也是藥品穩(wěn)定性評(píng)價(jià)中需重點(diǎn)考察的項(xiàng)目。 有關(guān)物質(zhì)檢查常用的方法之一 是HPLC主成分自身對(duì)照法（紫外檢測(cè)器），即將HPLC色譜圖中雜質(zhì)峰面積與主成分 自身對(duì)照液峰面積進(jìn)行比較，以確定雜質(zhì)限度是否合格。采用此方法時(shí)確定的檢測(cè)波 長(zhǎng)是否合理直接影響到方法的可行性，因此檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇是方法學(xué)研究的重要內(nèi)容 。 在審評(píng)中發(fā)現(xiàn)一些申報(bào)單位在采用HPLC主成分自身對(duì)照法檢查有關(guān)物質(zhì)時(shí)直接或 間接地以主成分的最大吸收波長(zhǎng)作為檢測(cè)波長(zhǎng)，由于有關(guān)物質(zhì)檢查的對(duì)象是雜質(zhì)，若 將主藥的最大吸收波長(zhǎng)確定為檢測(cè)波長(zhǎng)，則雜質(zhì)在此波長(zhǎng)下的吸收可能偏低，某些雜 質(zhì)甚至無(wú)吸收，這樣會(huì)造成對(duì)雜質(zhì)含量的低估甚至漏檢，從而不能反映產(chǎn)品的真實(shí)質(zhì) 量，影響了對(duì)品種質(zhì)量可控性及穩(wěn)定性的評(píng)價(jià) 在有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)波長(zhǎng)確定方面，申報(bào)資料中比較常見的做法有： 1．直接將主藥的最 大吸收波長(zhǎng)選作檢測(cè)波長(zhǎng)。 2．簡(jiǎn)單地套用含量測(cè)定的色譜條件。在HPLC法進(jìn)行含量 測(cè)定時(shí)，為提高方法的靈敏度，降低干擾，往往選用主成分的最大吸收波長(zhǎng)作為檢測(cè) 波長(zhǎng)。若套用含量測(cè)定的色譜條件，實(shí)際仍是以主藥的最大吸收波長(zhǎng)作為有關(guān)物質(zhì)檢 測(cè)波長(zhǎng)。 3．以樣品進(jìn)行破壞性試驗(yàn)（酸、堿、熱、光照、氧化等）后的溶液做紫外 掃描，將掃描圖譜中最大吸收波長(zhǎng)確定為有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)波長(zhǎng)。因破壞性試驗(yàn)后溶液 中存在尚未破壞的主藥、降解產(chǎn)物、輔料等，此溶液的紫外吸收為各成分紫外吸收的 加和，并不能反映降解產(chǎn)物的紫外吸收特性。由于未破壞主藥所占比例較大，故破壞 性試驗(yàn)后溶液的最大吸收波長(zhǎng)一般仍為主藥的最大吸收波長(zhǎng)。 采用HPLC主成分自身 對(duì)照法檢查有關(guān)物質(zhì)，其前提之一是需檢查的雜質(zhì)與主成分在確定的檢測(cè)波長(zhǎng)下應(yīng)有 相近的紫外吸收（響應(yīng)值接近），選擇檢測(cè)波長(zhǎng)時(shí)需對(duì)產(chǎn)品中可能存在的雜質(zhì)（合成 原料、中間體、副產(chǎn)物以及降解產(chǎn)物）的紫外吸收特性進(jìn)行研究。已知雜質(zhì)的紫外吸 收特性可采用對(duì)其流動(dòng)相溶液直接進(jìn)行掃描的方法考察，未知雜質(zhì)（如未知降解產(chǎn)物 等）可通過(guò)二極管陣列檢測(cè)器考察其紫外吸收情況，根據(jù)各主要雜質(zhì)及主成分的紫外 吸收特性，選取響應(yīng)值基本一致的波長(zhǎng)作為有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)波長(zhǎng)。若對(duì)不同雜質(zhì)難于 找到均適宜的檢測(cè)波長(zhǎng)，可考慮選擇在不同波長(zhǎng)下分別測(cè)定，也可考慮采用加校正因 子的主成分自身對(duì)照法。只有經(jīng)試驗(yàn)研究確認(rèn)主成分的最大吸收波長(zhǎng)符合有關(guān)物質(zhì)檢 查對(duì)測(cè)定波長(zhǎng)的要求時(shí)，為方便操作，可選作有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)波長(zhǎng)，以與含量測(cè)定的 色譜條件一致。 另外，HPLC主成分自身對(duì)照法檢查有關(guān)物質(zhì)比較適用于對(duì)微量雜質(zhì) 總量的控制，也可用于單個(gè)雜質(zhì)的限度（一般不超過(guò)0.5%）控制。對(duì)于具有明確歸屬 的已知雜質(zhì)，建議采用雜質(zhì)對(duì)照品法進(jìn)行檢查。對(duì)于有毒有害雜質(zhì)，更應(yīng)采用雜質(zhì)對(duì) 照品法單獨(dú)測(cè)定，并制定嚴(yán)格的限度。 http://pharma.dxy.cn/news/50/54/19125.htm 不同波長(zhǎng)下測(cè)定藥品有關(guān)物質(zhì)的討論 某片劑，主藥在220nm、254nm下均有較強(qiáng)吸收，254nm吸收值約比220nm大一倍，含量測(cè)定采用254nm，現(xiàn)想對(duì)該藥物進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)檢查，波長(zhǎng)初步選擇為254nm，經(jīng)查國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)，并無(wú)該藥品的有關(guān)物質(zhì)檢查報(bào)道，我們想在質(zhì)量研究中增加在不同波長(zhǎng)下考察有關(guān)物質(zhì)的大小試驗(yàn)。 現(xiàn)分別采用220nm和254nm進(jìn)行同一份樣品進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)，大致現(xiàn)象為  1)220nm：雜質(zhì)峰面積明顯增大，主峰峰面積明顯減小，故歸一化法雜質(zhì)明顯增大，總雜質(zhì)約1.5%，新增2個(gè)雜質(zhì)，共5個(gè)雜質(zhì)；(2)254nm：雜質(zhì)峰面積小，主峰面積大，歸一化法總雜質(zhì)約0.3%，共3個(gè)雜質(zhì)；試問(wèn)，在這種情況下，該如何合理的對(duì)比雜質(zhì)大小、個(gè)數(shù)？我資料中體現(xiàn)了粗品與強(qiáng)制降解產(chǎn)物的全波長(zhǎng)掃描，當(dāng)時(shí)考慮到各雜質(zhì)的最大吸收均 在280nm，因此就選擇了280nm作為有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)波長(zhǎng)，當(dāng)時(shí)也比較了低波長(zhǎng)處的 歸一化限度均小于280nm，但是沒有寫到資料里去，因此感覺比較冤。 這也體現(xiàn)出目前對(duì)雜質(zhì)研究的重視，對(duì)于雜質(zhì)來(lái)說(shuō)在有較強(qiáng)吸收的地方，分別比較雜 質(zhì)的檢出個(gè)數(shù)與總量，最終根據(jù)雜質(zhì)的量與個(gè)數(shù)確定合適的波長(zhǎng)，當(dāng)然DAD檢測(cè)器成 為首選，以粗品與降解產(chǎn)物進(jìn)行DAD測(cè)定是目前的基本要求，審核人員希望看到你為 建立專屬性強(qiáng)的方法做了全面的工作，所選波長(zhǎng)基本能檢出所有雜質(zhì)，并且雜質(zhì)量也 是最多的。曾經(jīng)咨詢過(guò)專家的意見，很多品種含量下降與有關(guān)物質(zhì)增加不符合，甚至 相差5～10倍，建立專屬的有關(guān)物質(zhì)方法是現(xiàn)在審核的中心。 基于上述理由嚴(yán)重建議做充分的工作，比較粗品與強(qiáng)制降解產(chǎn)物的雜質(zhì)檢出個(gè)數(shù)與數(shù) 量（你新增的雜質(zhì)不一定是新增，可能由于濃度低而未檢出，采用強(qiáng)制降解一般不會(huì) 出現(xiàn)上述問(wèn)題，畢竟有關(guān)物質(zhì)與樣品的母體基本相同），最終確定有關(guān)物質(zhì)波長(zhǎng)，你 的理論上應(yīng)該選擇220nm而非254nm。最好以DAD檢測(cè)器得到的結(jié)果來(lái)證明。 首先254nm是苯環(huán)的B帶吸收。1.雜質(zhì)如果在此沒有吸收的話，他很可能不具有苯環(huán)結(jié)構(gòu)，這樣的雜質(zhì)有點(diǎn)超出一般意義下的雜質(zhì)，這樣的雜質(zhì)與主藥沒有直接的關(guān)系，可能來(lái)源于合成的起始原料等，具體可以參考合成工藝分析，由于一般帶有苯環(huán)的不太會(huì)后加苯環(huán)，這樣的可能性比較小。2.雜質(zhì)在254你們有最大吸收，單由于雜質(zhì)的吸收度小無(wú)法檢測(cè)出，這樣的選擇254nm是可以的�；蛘咴诖说奈障禂�(shù)比較小，這樣的需要加校正因子校正。 選擇低波長(zhǎng)是比較有風(fēng)險(xiǎn)的，國(guó)家局的意思也是要跟低波長(zhǎng)處的進(jìn)行比較，他可能希 望到此處的數(shù)據(jù)，譬如210nm檢出0.5%雜質(zhì)，280nm檢出0.4%雜質(zhì)，但是低波長(zhǎng)的干擾較大，或者某些殘留溶劑再此也有峰，選擇280nm也是可以的，210nm0.5%的雜質(zhì)、280nm0.4%的，你選擇280nm總會(huì)找出一些理由，如果你沒有給出低波長(zhǎng)下的數(shù)據(jù)審評(píng)人員心里沒數(shù)可能就要補(bǔ)你，固確定多出的這2個(gè)雜質(zhì)是需要關(guān)注的。 “說(shuō)得有點(diǎn)復(fù)雜哈，簡(jiǎn)單一點(diǎn)，主藥和雜質(zhì)通常情況下在一個(gè)波長(zhǎng)下均有吸收，怎么 證明我選擇主藥的最大吸收是合理的？” 證明雜質(zhì)與主藥的相應(yīng)因子在0.9～1.1之間，也可以反推220nm的相應(yīng)因子超過(guò)了1.1， 所以檢出的量是大的、假的。實(shí)際上制劑大于0.2%的未知雜質(zhì)需要結(jié)構(gòu)確證的，因此 最好搞到該雜質(zhì)的對(duì)照品，證明其220nm處其相應(yīng)因子不在0.9～1.1之間。原料是合法來(lái)源，但可能沒有控制有關(guān)物質(zhì)，如果有控建議參考其標(biāo)準(zhǔn)。220nm雜質(zhì)已經(jīng)超標(biāo)，最好不表述。如果表述則需要證明其不合理性。否則上述信息讓審評(píng)人員知道，1.5%與0.3%不研究明白肯定讓你再行研究。 實(shí)際上制劑大于0.2%的未知雜質(zhì)需要結(jié)構(gòu)確證的，因此最好搞到該雜質(zhì)的對(duì)照品，證 明其220nm處其相應(yīng)因子不在0.9～1.1之間。 摩爾吸收系數(shù)的比值在0.9～1.1，這是使用主成分自身對(duì)照法的沖要條件，否則需采 用自身對(duì)照法或者加校正因子的主成分自身對(duì)照法等。這一切的前提都是得到雜質(zhì)對(duì) 照品，目前制劑雜質(zhì)大于0.2%的也需要拿到雜質(zhì)對(duì)照品，并進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證，確定安全 性，目前申報(bào)的門檻大大提高了，是我輩的不幸啊。如果時(shí)間不允許也只能裝作不知 道，看審評(píng)中心的老師是否知道，他也不知道那就萬(wàn)事大吉，他知道那只能再補(bǔ)。你 這個(gè)品種一旦涉及到220nm，你里面就有超過(guò)0.2%的雜質(zhì)，需要按照指導(dǎo)原則進(jìn)行， 目前的政策就是不能有超過(guò)0.2%的雜質(zhì)出現(xiàn)，超過(guò)了結(jié)構(gòu)確證，有文獻(xiàn)報(bào)道該雜質(zhì)安 全，則不需要進(jìn)行安全性試驗(yàn)，否則進(jìn)行。 220nm：雜質(zhì)峰面積明顯增大，主峰峰面積明顯減小，故歸一化法雜質(zhì)明顯增大，總 雜質(zhì)約1.5%，新增2個(gè)雜質(zhì)，共5個(gè)雜質(zhì)；在220nm處歸一化法檢測(cè)雜質(zhì)要充分考慮輔料的干擾，因?yàn)檩o料在此波長(zhǎng)均有很強(qiáng)的吸收，若為小劑量產(chǎn)品，小藥丸説的在 220nm主藥和雜質(zhì)各占50%左右是很有可能的，若必需在220nm處檢測(cè)雜質(zhì)，一定要減去輔料的吸收，但輔料降解產(chǎn)物的影響仍然是未知數(shù)。 有關(guān)物質(zhì)波長(zhǎng)的選擇最好是有雜質(zhì)對(duì)照品，先確定每個(gè)雜質(zhì)的最大吸收波長(zhǎng)，然后選 擇主藥最大吸收波長(zhǎng)附近的波長(zhǎng)作為檢測(cè)波長(zhǎng)，且該波長(zhǎng)下雜質(zhì)要有較大的吸收值， 然后研究響應(yīng)因子。此條國(guó)內(nèi)一般不愿去做，工作量大，費(fèi)用高，但是是以后的方向 。 選擇粗品和破壞的全波段掃描，來(lái)確定不同波長(zhǎng)下的有關(guān)物質(zhì)情況，比如雜質(zhì)數(shù)目， 雜質(zhì)的歸一化百分比等，但是不是有關(guān)越高越好，最好還是選擇和主藥與雜質(zhì)的最大 吸收波長(zhǎng)最接近的波長(zhǎng)。 個(gè)人認(rèn)為，有關(guān)物質(zhì)的研究在國(guó)內(nèi)還是處在尷尬的境地，即使選擇了雜質(zhì)最大的波長(zhǎng) 仍然不能保證把所有雜質(zhì)都檢測(cè)出來(lái)，用液相方法只是比薄層先進(jìn)些罷了，細(xì)想還是 很可笑的。好多工作不可能去做，所以，只能想些辦法，只要能夠說(shuō)服評(píng)審老師就行 了，口服制劑花那么大功夫研究本來(lái)就有問(wèn)題的問(wèn)題，實(shí)在是浪費(fèi)。 應(yīng)找到合適的理由將有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)波長(zhǎng)定在254nm，否定220nm是關(guān)鍵 http://www.sepu.net/dvbbs/dispbb ... p;page=0&star=1 做有關(guān)物質(zhì)常常需要看看產(chǎn)品與它的最后幾步中間體是否能分得開對(duì)吧？我的做法是 把產(chǎn)品和中間體都配成相同濃度的溶液，在紫外上掃描，然后找一個(gè)產(chǎn)品和中間體有 相似吸收的波長(zhǎng)作為HPLC的檢測(cè)波長(zhǎng)，并不一定要選產(chǎn)品的最大吸收波長(zhǎng)，請(qǐng)問(wèn)這 樣對(duì)嗎？今天下午問(wèn)了一個(gè)做新藥的前輩，可他說(shuō)一般都是選擇的產(chǎn)品的最大吸收波 長(zhǎng)。但是我的幾個(gè)中間體在產(chǎn)品的最大吸收處吸收都很小，這樣怎么能起到檢測(cè)的作 用呢？因?yàn)榧词菇K產(chǎn)品帶有大量的中間體，在HPLC上也只能檢測(cè)出一點(diǎn)甚至是檢測(cè) 不出來(lái)，那么這個(gè)有關(guān)物質(zhì)的方法還有什么意義？前輩給的說(shuō)法是如果中間體沒有什 么安全性方面的問(wèn)題，這些都無(wú)所謂！我就疑惑了。請(qǐng)高手指點(diǎn)！ 謝謝各位了。其實(shí)要是只選擇在一個(gè)波長(zhǎng)下來(lái)檢測(cè)有關(guān)物質(zhì)，總有弊端的不是，因?yàn)?br /> 樣品、中間體、副產(chǎn)物及降解產(chǎn)物他們的吸收不盡相同，甚至有的相差特別大，如果 他們的含量都比較高的話，有的東西根本檢測(cè)不出來(lái)的。有人說(shuō)應(yīng)該不同的有關(guān)物質(zhì) 選不同的波長(zhǎng)檢測(cè)，這樣也許會(huì)好一點(diǎn)，但是目前的新藥研究好像沒有這么細(xì)致，再 說(shuō)有的中間體含量甚少，而有的雜質(zhì)又是未知的，得不到對(duì)照的東西，也就無(wú)從下手 ，看來(lái)也就只好隨波逐流選一個(gè)樣品的最大吸收波長(zhǎng)先做了，時(shí)間太緊了！再次感謝 各位哈！ 這不是隨波逐流，這也是一種方法，有時(shí)候理論和實(shí)踐不可能同意的很好��！ 如果你把標(biāo)準(zhǔn)定成很多波長(zhǎng)檢測(cè)有關(guān)物質(zhì)，對(duì)以后的檢驗(yàn)會(huì)非常不利，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要定 的即合理又科學(xué)！！只科學(xué)，不合理是不成功的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。 就像你的前輩的說(shuō)法，如果中間體沒有什么安全性方面的問(wèn)題，可以不用考慮那么多 ��！ 對(duì)于已知的雜質(zhì)，也不一定選擇雜質(zhì)的最大吸收波長(zhǎng)來(lái)檢查��！因?yàn)槟銘?yīng)該有 雜質(zhì)對(duì)照！！ 如果根本沒有紫外吸收，多數(shù)可以不做考察；如果非得做考察，可以采用ELSD或RI 檢測(cè)，或者采用TLC的方法，用顯色法檢查。 |
12樓2011-02-18 03:58:26
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3樓2011-02-16 16:49:18
5樓2011-02-16 17:03:19
6樓2011-02-16 17:03:42
小猴nicky
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8樓2011-02-16 18:39:27
癡夷子皮
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不是用主成分的檢測(cè)波長(zhǎng)嗎？ 9樓2011-02-16 19:57:15
10樓2011-02-16 22:10:42
11樓2011-02-17 08:46:26
13樓2012-05-15 12:44:08
14樓2012-07-04 20:29:20
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