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olifor2010金蟲 (正式寫手)
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[交流]
【交流】HPLC相同條件下，為何我們檢測不出主峰雜質(zhì)？ 已有8人參與
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現(xiàn)在的問題是，一種樣品，相同批次，色譜條件相同，為何我公司檢測不出雜質(zhì)，而客戶就能檢測出雜質(zhì)？ 色譜條件如下： 色譜柱——Hypersil BDS C18色譜柱（250mm*4.6mm*5µm） 流動(dòng)相—— 溶劑A：溶劑B=90:10 溶劑A—用水溶解2.33g庚烷磺酸鈉，加2.5ml的85%的磷酸，溶于400ml水中，用25%的氨水調(diào)節(jié)pH為2.5后加水至500.0ml。 溶液B—乙腈 檢測波長——205±4nm，標(biāo)準(zhǔn)360±20nm。 流速：1mL/min 色譜儀：Agilent1100 DAD HPLC 現(xiàn)在的問題是: 客戶檢我們每一批樣品主峰后的一個(gè)雜質(zhì),而我們怎么檢主峰后都沒有雜質(zhì)?但他們的溶劑進(jìn)樣后與我們是一致的, 客戶檢的色譜圖如下: 局部方法圖如下: 客戶標(biāo)準(zhǔn)中要求系統(tǒng)適用性與系統(tǒng)精密度我們完全達(dá)到了。 即我們檢測不出客戶檢的8.3min的雜質(zhì)。 請教高手幫助分析下原因，多謝！ [ Last edited by olifor2010 on 2011-2-23 at 18:57 ] |
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2樓2011-02-23 08:53:14
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3樓2011-02-23 14:24:27
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4樓2011-02-23 15:29:12
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5樓2011-02-23 18:59:22
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7樓2011-02-26 21:16:00
這篇文章可以了解一下離子對試劑
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我找了一篇以前看的文章，是關(guān)于離子對的，現(xiàn)在也在做，出了很多問題，不知道是否適合你了解離子對試劑。 離子對試劑介紹 離子對試劑的優(yōu)點(diǎn) 在過去，帶電荷分析物的色譜分離通過離子抑制（小心調(diào)節(jié)流動(dòng)相PH值以使分析物非離子化）來達(dá)到。然而，要確定離子抑制狀態(tài)下的最佳流動(dòng)相PH值，卻往往需要額外的摸索過程。含有一個(gè)以上的可離子化成分的樣品，通常是不穩(wěn)定的。離子抑制的局限性導(dǎo)致了一種新的、更普遍適用的方法進(jìn)行可離子化物質(zhì)色譜分離的方法：離子對色譜。 離子對色譜由Gordon Schill博士于1973年建立，其方法是將離子性化合物添加到流動(dòng)相中以促使離子與帶電荷分析物形成配對離子。這些試劑由帶有可離子化終端的烷基鏈組成。當(dāng)在反相條件下用于常見的憎水性HPLC固定相時(shí)，離子對試劑可選擇性的增加帶電荷分析物的保留時(shí)間。 盡管離子交換色譜已經(jīng)成為常見的分離模式，它并非在所有情況下都起作用。較離子交換色譜，離子對色譜的優(yōu)點(diǎn)在于： 1、緩沖液制備簡單； 2、碳鏈長度選擇眾多，可用于增加保留時(shí)間、改善分離性質(zhì)； 3、顯著縮短分離時(shí)間； 4、同時(shí)分離離子化和非離子化分析物； 5、分析結(jié)果重現(xiàn)性極好； 6、改善峰形。 Regis提供的離子對試劑 Regis生產(chǎn)超純的陰離子磺酸鹽（S-系列）和陽離子季胺（Q-系列）離子對濃縮液，碳鏈長度有：戊、己、庚、辛和月桂(十二)。在我們的產(chǎn)品命名中，碳鏈長度以紅色數(shù)字標(biāo)出，如：5，6，7，8和12。 純度是關(guān)鍵因素 在我們生產(chǎn)離子對試劑的過程中，純度是非常重要的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。Regis S-和Q-系列離子對試劑根據(jù)工業(yè)最高質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行合成，從而得到超乎尋常的純度。這一點(diǎn)可參見表1：在波長低至200nm時(shí)對于Regis S-和Q-系列離子對試劑均可達(dá)到紫外透過性。在大部分情況下，這些紫外吸收值要低于用于HPLC梯度洗脫的乙腈和甲醇的紫外吸收值。盡管S-和Q-系列離子對試劑能在低于210nm的波長下使用，決定使用什么波長的關(guān)鍵因素還是在于檢測器鏡片和有機(jī)該性劑（如甲醇等）的綜合情況。 表1：典型的光學(xué)吸收值[AUFS]（濃度0.005M） 光學(xué)吸收[AUFS] 光學(xué)吸收[AUFS] S-系列 200nm 210nm Q-系列 200nm 210nm S5 0.006 0.002 Q5 0.060 0.001 S6 0.048 0.018 Q6 0.059 0.006 S7 0.008 0.001 Q7 0.022 0.009 S8 0.001 0.003 Q8 0.082 0.003 S12 0.002 0.003 Q12 0.102 0.013 乙腈 0.076 0.013 甲醇 0.940 0.510 Regis還提供批量磺酸鹽和幾種補(bǔ)充批量離子對試劑以及Rivier緩沖劑以補(bǔ)充磺酸鹽S-系列和季胺Q-系列的分離能力。 如何為分析方法的建立選擇合適的Regis離子對試劑 要選擇合適的試劑，必須考慮烷烴長度。不同的烷烴鏈長度使得能夠選擇性分離分析物。鏈越長，離子對的憎水性越強(qiáng)，從而，保留時(shí)間也就越長。當(dāng)鏈長度由戊基(Q5)增加到月桂基(Q12)時(shí)，保留因子幾乎增長了20倍，如表2和表3所示。表2和表3中的數(shù)據(jù)顯示出Q-試劑鏈長度決定了苯甲酸的保留時(shí)間，但不會(huì)影響到苯甲醇的保留時(shí)間。對于S-系列試劑也可以觀察到類似的選擇性。 表2：保留時(shí)間與鏈長度的關(guān)系 Q-系列 保留時(shí)間(min) 保留時(shí)間比 苯甲酸/苯甲醇 苯甲酸 苯甲醇 Q5 4.53 9.17 0.49 Q6 6.50 8.60 0.76 Q7 8.24 9.13 0.90 Q8 12.36 8.94 1.38 Q12 79.53 8.52 9.33 表3：保留時(shí)間比R與PH的關(guān)系 （流動(dòng)相－水/甲醇 60/40中，R為苯甲酸和苯甲醇地保留時(shí)間比） Q6 Q7 Q8 pH R pH R pH R 7.50 0.59 7.50 0.88 7.51 1.06 6.50 0.70 6.51 1.00 6.54 1.29 5.50 0.96 5.52 1.23 5.50 1.59 以下是使用Regis離子對試劑來成功建立分析方法的指導(dǎo)： 1. 選擇一根色譜柱，常為C18柱； 2. 準(zhǔn)備流動(dòng)相時(shí)僅使用HPLC級別的水和色譜級試劑； 3. 選擇能給出最佳分離度的流動(dòng)相成分和濃度； 4. 如果樣品中有非離子化物質(zhì)，在嘗試離子化分離之前首先優(yōu)化分離情況； 5. 選擇合適的離子對系列試劑以提供相應(yīng)的離子配對：對于酸性分析物使用Q-系列離子對試劑；對于堿性分析物使用S-系列離子對試劑； 6. 通過比較選擇所得分離度最好的離子對試劑； 7. 一旦離子對試劑已經(jīng)確定，調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH值將分離度最大化；因?yàn)槲⑿〉膒H值改變對保留性質(zhì)和選擇性都有較大的影響，所以仔細(xì)小心的小幅度調(diào)節(jié)pH值（參見表3）； 8. 理想狀況下，流動(dòng)相中的離子對試劑濃度應(yīng)為0.005M，但是稍微增加離子對試劑可能會(huì)稍微增加保留性質(zhì)并因此優(yōu)化分離情況。 Regis 離子對試劑現(xiàn)貨價(jià)目表： 貨號 品名 包裝 CFCQ-403026-25G 1-HEXANESULFONATE,SODIUM SALT (1-己烷磺酸鈉) 25GM CFCQ-403027-25G 1-HEPTANESULFONATE,SODIUM SALT (1-庚烷磺酸鈉) 25GM CFCQ-403127-100G 1-HEPTANESULFONATE,SODIUM SALT (1-庚烷磺酸鈉) 100GM CFCQ-403028-25G 1-OCTANESULFONATE,SODIUM SALT (1-辛烷磺酸鈉) 25GM 2.2 高效液相色譜分離 HPLC-ICP-MS聯(lián)用技術(shù)在元素化學(xué)形態(tài)分析中的應(yīng)用，已有文獻(xiàn)總結(jié)；該技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是應(yīng)用范圍廣。以下是幾種常用于形態(tài)分析的HPLC技術(shù)。 2.2.1 體積排阻色譜(SEC) SEC是按溶質(zhì)的分子大小來分離的。其優(yōu)點(diǎn)是：未知分子質(zhì)量的樣品在末端時(shí)間或在此之前淋出，因而可以預(yù)測色譜運(yùn)行的終點(diǎn)；未知物的分子質(zhì)量可以用校正的色譜系統(tǒng)來表征。SEC通常不會(huì)引起元素形態(tài)的丟失，適用于不穩(wěn)定或與金屬絡(luò)合較弱的生物大分子。缺點(diǎn)是容量有限，不能分辨多組分樣品，僅能分離分子大小不同且不能吸附在柱上的分析物。此外，有些化合物的保留時(shí)間會(huì)遷移至淋洗體積的末端以外，有時(shí)還會(huì)產(chǎn)生吸附效應(yīng)和憎水效應(yīng)，這些現(xiàn)象均會(huì)導(dǎo)致化學(xué)形態(tài)的轉(zhuǎn)變和破壞。 2.2.2 離子交換色譜(IEC) 與SEC相比，IEC最主要的優(yōu)點(diǎn)是分離效率高，應(yīng)用范圍廣。分離過程基于帶電溶質(zhì)離子與固定相的反電荷表面的交換平衡。溶質(zhì)離子與流動(dòng)相中的等電荷離子競爭固定相上的反離子。這種競爭決定了離子的相對保留時(shí)間，它依賴于流動(dòng)相的pH值、離子強(qiáng)度和離子交換劑的性質(zhì)。淋洗液中如含有高濃度的鹽類，將會(huì)影響與ICP-MS的接口。 此外不穩(wěn)定的金屬-蛋白的絡(luò)合物中的金屬會(huì)被緩沖液中的金屬所代替。所以，IEC經(jīng)常應(yīng)用于以共價(jià)鍵結(jié)合的硒氨基酸或砷化合物。 2.2.3 反相高效液相色譜(RP-HPLC) RP-HPLC利用極性較流動(dòng)相弱的固定相來分離分析物。保留機(jī)制是基于分析物的憎水性。該方法的應(yīng)用范圍廣，對不同形態(tài)的分辨率高，重復(fù)性好。但是，固定相有離子交換性質(zhì)，在pH>4時(shí)堿性分析物在柱上的吸附力很強(qiáng)。一般應(yīng)用兩種不同的淋洗液，其中至少有一種含有相當(dāng)量的有機(jī)改進(jìn)劑。淋洗生物分子需要用有機(jī)溶劑，還經(jīng)常需要用酸。有機(jī)溶劑和酸很容易改變形態(tài)如蛋白-金屬絡(luò)合物。蛋白質(zhì)被打開后，釋放的金屬即與其它絡(luò)合劑結(jié)合導(dǎo)致形態(tài)改變。所以，RP-HPLC適用于分離以共價(jià)鍵結(jié)合的金屬絡(luò)合物而不適用于不穩(wěn)定的金屬絡(luò)合物。 2.2.4 離子對色譜(IP-RPLC) RP-HPLC僅能分離非極性不帶電的分析物。在分離帶電的極性分析物時(shí)需要用離子對試劑。固定相是標(biāo)準(zhǔn)硅烷化的硅膠填料(如C8或C18。)，流動(dòng)相是由如磷酸鹽或醋酸鹽、有機(jī)改進(jìn)劑(甲醇或乙腈)和離子對試劑組成的水溶液緩沖體系。離子對試劑與分析物生成離子對保留在反相柱上。離子對試劑參與流動(dòng)相中分析物與非極性固定相之間的平衡。在考慮離子對試劑時(shí)應(yīng)盡量用溶于流動(dòng)相的去質(zhì)子的一價(jià)反離子，并對色譜柱和分析物不造成損害。用緩沖溶液控制水相的pH值和反離子的濃度以避免峰拖尾和出現(xiàn)多峰至關(guān)重要。與RP-HPLC相比，IR-RPLC的優(yōu)點(diǎn)是方法的靈活性和多樣性增加了�？梢詾橐环N特定的要求來設(shè)計(jì)分離條件。但是，方法所用的有機(jī)溶劑和酸也會(huì)影響元素的形態(tài)。離子對試劑更加重了這些問題，于是對分析物的穩(wěn)定性的要求比單獨(dú)使用RP-HPLC更高。 |
8樓2011-02-26 21:53:42
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9樓2011-02-27 07:14:48
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首先非常感謝您老師！感謝您在百忙之中抽出時(shí)間來回復(fù)我，您是如此的熱情與慷慨：） 您發(fā)的這篇文章對我?guī)椭艽�，使我意識到離子對色譜的流動(dòng)相的pH值是非常重要的； 正如文章中所說，流動(dòng)相的pH值控制非常精確，才可以； 我們實(shí)驗(yàn)室分別使用了5個(gè)人配置的流動(dòng)相，2個(gè)人的出現(xiàn)了主峰分叉，即多峰現(xiàn)象，目前我還不是太明白原因（一般色譜出現(xiàn)多峰是由于柱填料塌陷造成的），1個(gè)人配置的流動(dòng)相主峰后有小臺階狀突起，2個(gè)人配置流動(dòng)相主峰非常漂亮； 老師您能否就pH原因造成分叉進(jìn)行進(jìn)一步的講解呢？ |
10樓2011-02-27 22:58:16
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