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【求助/交流】求構(gòu)載體高手 賜教構(gòu)建亞細胞定位載體pCAMBIA1302
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最近要做一個亞細胞定位實驗 載體信息如下： 用于植物轉(zhuǎn)基因的雙元轉(zhuǎn)化載體. 主要用途，以gfp為基礎(chǔ)的分子定位 檢測rbcs的導(dǎo)肽對蛋白定位的作用 插入使用說明： gfp:的閱讀框在酶切位點上的分布如下： NcoI-----BglII----- SpeI CC ATG GtA GAT CTg ACT AGT aaa gga gaa ga ---M---V---D---L---T-- S-- K-- G-- E-- X 由于我的基因ORF內(nèi)部有bgl II位點 所以只能選擇Nco I 和SpeI 但是我的基因閱讀框起始密碼子位置是這樣的 CCATGGG ，加粗部分是我的起始密碼子，本身構(gòu)成了一個NcoI位點，所以我在設(shè)計引物的時候就把CC換成了其他堿基如AT。 但是我現(xiàn)在有一個問題沒有弄清楚，就是從35S啟動子往下算的第一個堿基到我的ATG起始密碼子這一段是不是必須是3的倍數(shù)，由于NcoI本身存在一個ATG，我應(yīng)該怎么設(shè)計引物才會編碼出正確的蛋白呢？ 我今天設(shè)計了一條引物 正向的：圖三，我現(xiàn)在就是不知道這個起始密碼子到35S啟動子末這段是怎么算的。 分子生物學(xué)沒學(xué)到家，哎！ [ Last edited by lxjwishes on 2011-3-2 at 20:48 ] |
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2樓2011-03-02 21:15:16
3樓2011-03-02 21:37:17
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載體使用信息:--------------------------------------------------------------------------- 用于植物轉(zhuǎn)基因的雙元轉(zhuǎn)化載體. 篩選標(biāo)記:潮霉素 主要用途，以gfp為基礎(chǔ)的分子定位 檢測rbcs的導(dǎo)肽對蛋白定位的作用 插入使用說明： gfp:的閱讀框在酶切位點上的分布如下： NcoI-----BglII----- SpeI CC ATG GtA GAT CTg ACT AGT aaa gga gaa ga ---M---V---D---L---T-- S-- K-- G-- E-- X sp：Ama signal序列： 1 MAKRIASMSS LLLIALLCLS SHLAQAQVL --> GFP的蛋白序列： --> 1 DLTSKGEELF TGVVPILVEL DGDVNGHKFS VSGEGEGDAT YGKLTLKFIC 51 TTGKLPVPWP TLVTTFSYGV QCFSRYPDHM KRHDFFKSAM PEGYVQERTI 101 FFKDDGNYKT RAEVKFEGDT LVNRIELKGI DFKEDGNILG HKLEYNYNSH 151 NVYIMADKQK NGIKANFKTR HNIEDGGVQL ADHYQQNTPI GDGPVLLPDN 201 HYLSTQSALS KDPNEKRDHM VLLEFVTAAG ITHGMDELYK ASHHHHX --> sp_gfp序列： 構(gòu)建方案采取NcoI 和 SpeI連接結(jié)果正確。 --> 1 MAKRIASMSS LLLIALLCLS SHLAQAQVLT SKGEELFTGV VPILVELDGD 51 VNGHKFSVSG EGEGDATYGK LTLKFICTTG KLPVPWPTLV TTFSYGVQCF 101 SRYPDHMKRH DFFKSAMPEG YVQERTIFFK DDGNYKTRAE VKFEGDTLVN 151 RIELKGIDFK EDGNILGHKL EYNYNSHNVY IMADKQKNGI KANFKTRHNI 201 EDGGVQLADH YQQNTPIGDG PVLLPDNHYL STQSALSKDP NEKRDHMVLL 251 EFVTAAGITH GMDELYKASH HHHX --> 載體設(shè)計： AmaspNocI+: CAT CCATGG ATGGCAAAGCGCATAGCCTC 66/58℃ AmaspSpeI-: CTC ACTAGT GAGGACCTGGGCTTGGGC 66/60℃ ----------------------------------------------------------------------------------------------- 附：O.sativa alpha-amylase (alpha-Amy3) gene LOCUS RICAMYA 1317 bp DNA linear PLN 27-APR-1993 DEFINITION O.sativa alpha-amylase (alpha-Amy3) gene, complete cds. ACCESSION M24941 VERSION M24941.1 GI:169774 KEYWORDS alpha-amylase; alpha-amylase 3. SOURCE Oryza sativa (rice) ORGANISM Oryza sativa Eukaryota; Viridiplantae; Streptophyta; Embryophyta; Tracheophyta; Spermatophyta; Magnoliophyta; Liliopsida; Poales; Poaceae; BEP clade; Ehrhartoideae; Oryzeae; Oryza. REFERENCE 1 (bases 1 to 1317) AUTHORS Sutliff,T.D., Huang,N. and Rodriguez,R.L. TITLE Isolation and characterization of a rice alpha-amylase multigene locus JOURNAL Unpublished (1989) COMMENT Original source text: O.stativa (strain cv. M202; EMBL4 library) leaf DNA. Draft entry and computer-readable sequence for [1] kindly submitted by T.D.Sutliff, 26-MAY-1989. FEATURES Location/Qualifiers source 1..1317 /organism="Oryza sativa" /mol_type="genomic DNA" /db_xref="taxon:4530" CDS 1..1317 /note="alpha-amylase precursor (EC 3.2.1.1)" /codon_start=1 /protein_id="AAA33897.1" /db_xref="GI:169775" /translation="MAKRIASMSSLLLIALLCLSSHLAQAQVLFQGFNWESWKKQGGW YNFLHGHVDDIAATGVTHVWLPPPSHSVAPQGYMPGRLYDLDASKYGTGAELRSLIAA FHSKGIKCVADIVINHRCADYKDSRGIYCIFEGGTPDSRLDWGPDMICSDDTQYSNGR GHRDTGADFGAAPDIDHLNTRVQTELSDWLNWLKSDVGFDGWRLDFAKGYSAAVAKTY VDNTDPSFVVAEIWSNMRYDGNGEPSWNQDGDRQELVNWAQAVGGPASAFDFTTKGEL QAAVQGELWRMKDGNGKAPGMIGWLPEKAVTFIDNHDTGSTQNSWPFPSDKVMQGYAY ILTHPGVPCIFYDHVFDWNLKQEISTLAAVRSRNEIHPGSKLKILAAEGDVYVAMIDD KVITKIGTRYDVGNLIPSDFHVVAHGNNYCIWEKSGLRVPAGRHHY" sig_peptide 1..78 /note="alpha-amylase signal peptide" mat_peptide 76..1314 /product="alpha-amylase" ORIGIN Unreported. 1 atggcaaagc gcatagcctc aatgagcagc ctcctcctta tcgccttgct ctgtctgagc 61 tctcacttgg cccaagccca ggtcctcttc caggggttca actgggagtc gtggaagaag 121 cagggcgggt ggtacaactt cctccatggc cacgtcgacg acatcgccgc gaccggtgtc 181 acgcacgtct ggctcccacc gccgtcgcac tccgtcgccc cgcagggata catgccgggc 241 cggctctacg acctggacgc ttccaagtac ggcacggggg cagagctcag gtcgctgatc 301 gccgccttcc acagcaaagg catcaagtgc gtcgccgaca tcgtcatcaa ccaccggtgc 361 gcggattaca aggatagccg tggcatctac tgcattttcg agggtggcac gccggacagc 421 cgcctcgact ggggccccga catgatctgc agcgacgaca cgcagtactc caacggccgc 481 ggtcaccgcg acaccggcgc agacttcggc gcggcgcccg acatcgacca cctcaacacg 541 cgtgtgcaga cagagctgtc cgactggctc aattggctca agtccgacgt cggcttcgac 601 ggctggcgcc tcgacttcgc caagggatac tcggcggccg tcgccaagac gtacgtcgac 661 aacaccgacc cgtccttcgt cgtcgccgag atatggagca acatgcgtta cgacggcaac 721 ggtgagccgt cgtggaacca ggacggtgac cggcaggagc tggtgaactg ggcgcaggcc 781 gtcggtggcc ctgcgtcagc gttcgacttc acgaccaagg gcgagctgca ggcggcggtg 841 caaggtgagc tgtggcggat gaaggacggc aacggcaagg cgccggggat gattggctgg 901 ctgccagaga aggccgtcac cttcatcgac aaccatgaca ctggctccac acagaactca 961 tggccgttcc cctccgacaa ggtcatgcag ggctacgcct acatcctcac acaccctgga 1021 gtaccctgca ttttctacga ccatgtattt gactggaacc tgaagcagga gatcagcaca 1081 ttagctgcag tgagatcaag aaatgagatt catcccggga gcaagctgaa aatccttgct 1141 gctgagggag acgtctatgt cgccatgatc gatgataagg tcataacaaa gattgggaca 1201 cggtatgacg tgggcaactt aatcccgtca gacttccatg tcgttgctca cggcaacaat 1261 tactgcattt gggaaaagag cggtctcaga gttcctgcag ggcggcacca ctattag // |
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