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yabing0324

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[交流] 【求助/交流】克隆-定量-測(cè)序，結(jié)果怪異

大家好，我做熒光定量PCR,絕對(duì)定量，要制備質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，在做藍(lán)白斑篩選的時(shí)候沒(méi)有加IPTG和x-gal，我挑取單個(gè)白斑，提質(zhì)粒，普通PCR，擴(kuò)出目的條帶，然后系列梯度稀釋?zhuān)龆�，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果還挺好，可是等我測(cè)序結(jié)果回來(lái)時(shí)候，驚呆了，居然是質(zhì)粒的序列，難道是我目的片段沒(méi)有連接上？如果沒(méi)有連接上，PCR后電泳怎么出現(xiàn)了目的條帶，而且我同時(shí)做了四個(gè)目的片段的重組質(zhì)粒，僅有一個(gè)測(cè)出來(lái)是跟我做的菌具有100%的相似性，其他的都不是。到底怎么回事，正準(zhǔn)備重新做，但是為了避免悲劇再次重現(xiàn)，還是想請(qǐng)各位給我點(diǎn)指導(dǎo)意見(jiàn)，這次克隆時(shí)肯定會(huì)加 IPTG和x-gal避免假陽(yáng)性。
在此先謝謝各位關(guān)注小女小貼！

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1樓 2011-03-04 15:45:58

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yabing0324

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大家?guī)蛶涂蓱z的我吧

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5樓2011-03-04 22:26:30

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susizheng

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yabing0324(金幣+1): 2011-03-04 16:05:22

鑒定重組質(zhì)粒最保險(xiǎn)的方法是酶切鑒定。PCR不保險(xiǎn)。

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2樓2011-03-04 15:57:03

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Originally posted by susizheng at 2011-03-04 15:57:03:
鑒定重組質(zhì)粒最保險(xiǎn)的方法是酶切鑒定。PCR不保險(xiǎn)。

今天剛定了酶，準(zhǔn)備切一下，這個(gè)對(duì)酶的要求高嗎？請(qǐng)問(wèn)你通常用哪家公司的，我想訂生工的，不知道怎么樣

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3樓2011-03-04 16:07:17

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susizheng

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Originally posted by yabing0324 at 2011-03-04 16:07:17:
今天剛定了酶，準(zhǔn)備切一下，這個(gè)對(duì)酶的要求高嗎？請(qǐng)問(wèn)你通常用哪家公司的，我想訂生工的，不知道怎么樣

酶的要求不那么高，生工的沒(méi)用過(guò)。用過(guò)Fermentas的。

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4樓2011-03-04 16:13:36

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