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[交流]
測序結(jié)果的疑問
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前面利用CODEHOPE設(shè)計了簡并引物，克隆一個基因片段�，F(xiàn)在測序結(jié)果已經(jīng)出來，令我很疑惑。 割膠回收后連接PMD18載體后，涂平板，挑單菌過夜搖菌，之后提質(zhì)粒酶切，送去測序。 現(xiàn)在問題來了，同一個平板出來的克隆，測序結(jié)果不同，有80%左右的相似性。BLAST后都與相關(guān)基因具有比較高的同源性。 現(xiàn)在一共送去了11個克隆測序，目前粗粗看了一下至少有4個不同的片段，之間一般是具有80%左右的同源性。 請問這是怎么回事？基因家族？我要克隆的這個基因是具有基因家族的傳統(tǒng)的，擬南芥等植物里一般有4-8個基因家族是很正常的。 還是測序問題？ 令外問一個令我不解的問題，植物的基因組應(yīng)該是固定的吧，那么那么多基因家族，對應(yīng)的外顯子應(yīng)該不同，怎么能一一對應(yīng)基因組DNA呢？ 望大家解惑，謝謝！ |
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shizishanshang(金幣+1):謝謝參與
silicare(金幣+3, EPI+1): 前提是PCR沒有突變 2011-07-05 12:12:51
shizishanshang(金幣+2): 謝謝啊，看著BLAST結(jié)果頭暈著呢 2011-07-05 17:22:40
shizishanshang(金幣+1):謝謝參與
silicare(金幣+3, EPI+1): 前提是PCR沒有突變 2011-07-05 12:12:51
shizishanshang(金幣+2): 謝謝啊，看著BLAST結(jié)果頭暈著呢 2011-07-05 17:22:40
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肯定不是測序的問題。對于植物來說最大的可能是因為大的基因家族,也有可能是選擇性剪切.不知道你說得相似性是怎么算出來的,是SNP還是有插入或者確實的片段？做過blast沒有呢，可以試一下用clustalx或者seqman等比一下看看。 怎么能一一對應(yīng)基因組DNA呢？這句話沒看明白你是什么意思，你是問如何去對應(yīng)還是已經(jīng)對應(yīng)了你不理解為什么？ 你可以通過比對基因組序列和mRNA序列來分析你這些序列所對應(yīng)的基因組的結(jié)構(gòu)的，這個可以幫助你確定他們是基因家族還是選剪以及是如何剪切的。植物的基因組有多倍體。 另外還有個問題，不知道的模板是DNA還是cDNA. |
2樓2011-07-05 10:39:32
★ ★ ★ ★
shizishanshang(金幣+1):謝謝參與
silicare(金幣+3, EPI+1): 有一定道理 2011-07-05 12:13:39
shizishanshang(金幣+1): 恩，問了一下公司說測序肯定沒有問題，我的片段大約850bp，測通的 2011-07-05 17:23:19
shizishanshang(金幣+2): 已經(jīng)證明是基因家族，全長已經(jīng)得到，既是做熒光定量不好設(shè)計引物了 2011-10-04 15:15:03
shizishanshang(金幣+1):謝謝參與
silicare(金幣+3, EPI+1): 有一定道理 2011-07-05 12:13:39
shizishanshang(金幣+1): 恩，問了一下公司說測序肯定沒有問題，我的片段大約850bp，測通的 2011-07-05 17:23:19
shizishanshang(金幣+2): 已經(jīng)證明是基因家族，全長已經(jīng)得到，既是做熒光定量不好設(shè)計引物了 2011-10-04 15:15:03
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測序?qū)Y(jié)果也是有較大影響的，并非樓上說的肯定不是測序的問題。 一般的測序儀在600以內(nèi)保證沒問題，800左右及以上就不準(zhǔn)確了，尤其是技術(shù)不過關(guān)的企業(yè)。 你通過兼并引物擴出來的片段我感覺更多的像是基因家族的多個成員，畢竟他們有著相似度很高的保守區(qū)段，當(dāng)然也不排除其他的可能…… |
3樓2011-07-05 10:45:59
4樓2011-07-05 10:50:48
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我是在NCBI上BLAST的了，通過BLASTN或者BLASTX都與已知的基因同源性比較高。我是用BLAST的里面的兩兩比較確定其相似性的。比如 Score = 663 bits (734), Expect = 0.0 Identities = 705/936 (75%), Gaps = 23/936 (2%) Strand=Plus/Plus Query 1 GAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGATTGGAGTACAAGCAAATCCAAAAGT 60 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 23 GAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGATTGGAGTACAAGCAAATCCAAAAGT 82 Query 61 AATGAACTGGTGAATGAGCATTAAGATGACGGCAGTGTCACGCCAGCCAGTCCTGGAGAG 120 ||| ||||| ||||| ||||| | ||||| ||| | || | | ||||| || | ||| Sbjct 83 AATAAACTGATGAATAAGCATGAGTATGACAGCACTATCTCTGAATCCAGTTCTTGGGAG 142 Query 121 AAGTGAGAAGGCGTTGGAATGATTGAGGAGTTGATCGCCGAATGCCCAGTAGACGGCGGT 180 | |||||| || |||| ||| | || || || || |||||||| || || || | Sbjct 143 CAATGAGAAAGCATTGGCATGGGTAAGAAGCATGTCTCCAAATGCCCAATACACAGCAGA 202 Query 181 GGCTGAGGGAATTGTTAATGTGAAAACGTACAAGGTAGCAAACAGATATATGTACTTGAA 240 || || || | || || || || || || | || || | || ||||| |||||| Sbjct 203 AGCCGATGGCAAAGTCAAGGTTAATACATAAAGTGTCGCCATCAAGTATATCACCTTGAA 262 Query 241 CTTTTGAGGTTTCCACATGGCGTGCATAATCTCCACAGTAACAGCGTGGCCACCAAAAGT 300 ||| || || |||||||| || ||||| ||||| || || ||||| || || ||||| || Sbjct 263 CTTCTGTGGCTTCCACATTGCATGCATGATCTCAACTGTGACAGCATGTCCCCCAAACGT 322 Query 301 GTACAGAATATTGGTAGCGCCAGTGAAGTACAGCACTAGCTTTGTCGGAGCCGAGTGTGA 360 ||| ||||| || ||||| ||||||||||| || || | || || || ||||||| Sbjct 323 GTAGAGAATGTTAGTAGCTCCAGTGAAGTAGAGAACCATTTTAGTTGGGCCCGAGTGCTT 382 Query 361 CACACCTTCAACCTGGCCATGTACAAGGGCGGCAATGGCCATATACCAGGCGGTGTAAGT 420 ||| ||||||||||| ||||| | |||| || |||| | |||||| || || ||||| Sbjct 383 CACTCCTTCAACCTGTCCATGAATTAGGGAAGCTATGGTTAAATACCATGCAGTATAAGT 442 Query 421 GGTCATGCCGAGGCCGAGAAAAGACCAGATTCGGTAGTTATGAAAGGAAGGGATGAACAC 480 ||||| ||||| | ||| ||||| |||| ||||||||| || || || || ||||| Sbjct 443 AGTCATCATAAGGCCAACAAATGACCAAATTCTGTAGTTATGGAATGAGGGAATAAACAC 502 或者，另外的對比后， Score = 746 bits (826), Expect = 0.0 Identities = 722/928 (78%), Gaps = 0/928 (0%) Strand=Plus/Plus Query 1 AGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGATTGGAGTACAAGCAAATCCAAAAGTAATGAAC 60 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 2 AGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGATTGGAGTACAAGCAAATCCAAAAGTAATGAAC 61 Query 61 TGGTGAATGAGCATTAAGATGACGGCAGTGTCACGCCAGCCAGTCCTGGAGAGAAGTGAG 120 || || ||||||||||| | ||| || |||| || || | ||| || ||| | Sbjct 62 TGATGGATGAGCATTAAAACGACAGCCATGTCTCGGAAGGGTGATTTGGGGAAAAGGGCA 121 Query 121 AAGGCGTTGGAATGATTGAGGAGTTGATCGCCGAATGCCCAGTAGACGGCGGTGGCTGAG 180 || |||||||| ||||| || || || || |||||||| ||||| || | || ||| Sbjct 122 AAAGCGTTGGAGTGATTAAGAAGCATGTCCCCAAATGCCCAATAGACAGCTGATGCCGAG 181 Query 181 GGAATTGTTAATGTGAAAACGTACAAGGTAGCAAACAGATATATGTACTTGAACTTTTGA 240 || | ||| | ||| ||||| || | || || | | |||||| |||||||||||| Sbjct 182 GGCAGTGTCAGTGTCAAAACATAGAGAGTCGCCAGTAAGTATATGGCCTTGAACTTTTGG 241 Query 241 GGTTTCCACATGGCGTGCATAATCTCCACAGTAACAGCGTGGCCACCAAAAGTGTACAGA 300 || |||||||| || ||||| || |||||||||||||| || || ||||| ||||| ||| Sbjct 242 GGCTTCCACATAGCATGCATTATTTCCACAGTAACAGCATGTCCTCCAAATGTGTAGAGA 301 Query 301 ATATTGGTAGCGCCAGTGAAGTACAGCACTAGCTTTGTCGGAGCCGAGTGTGACACACCT 360 || || || || || || || || | || ||||| || || | || ||| ||| ||| Sbjct 302 ATGTTTGTGGCTCCTGTAAAATATAACATCAGCTTGGTTGGGCCTGAATGTTTCACTCCT 361 Query 361 TCAACCTGGCCATGTACAAGGGCGGCAATGGCCATATACCAGGCGGTGTAAGTGGTCATG 420 || ||||||||||| | || || ||||||| | |||||| | |||||||| ||||| Sbjct 362 TCCACCTGGCCATGGAGGAGAGCAGCAATGGTGAGATACCAAGACGTGTAAGTTGTCATC 421 Query 421 CCGAGGCCGAGAAAAGACCAGATTCGGTAGTTATGAAAGGAAGGGATGAACACAGTGGTG 480 ||||||| ||||||||||| |||| |||||| ||||| ||||| ||||| || || || Sbjct 422 ACGAGGCCAAGAAAAGACCAAATTCTGTAGTTGTGAAATGAAGGAATGAAGACTGTAGTT 481 Query 481 GCACAGCAAGCACCAAAAATATAAGTCCATGTTCGCTTATCCAATCGGTCGTTGATGTAG 540 ||||||||||| || || || |||||||| || | ||| |||| ||| || ||||| -------------------- 不能上傳圖片，排列的很不齊啊。 我是用CDNA作模板的，還么有用DNA作模板擴。 |
5樓2011-07-05 17:19:12
6樓2011-07-05 17:22:05
7樓2011-07-06 09:28:32
8樓2011-07-06 09:38:20
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