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1樓 2011-07-06 13:37:29

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lxj341401

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1949stone(金幣+1): 疊峰最鬧心 2011-07-06 14:14:06

測出來是你要的話不用的，測一次就夠了。如果出現層疊峰、無信號等情況可以考慮重新送樣測序。

2樓2011-07-06 13:59:15

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friya0910

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Originally posted by lxj341401 at 2011-07-06 13:59:15:
測出來是你要的話不用的，測一次就夠了。如果出現層疊峰、無信號等情況可以考慮重新送樣測序。

我克一個基因，挑了三個單克隆測序，可是結果都不一樣，但是差得不多，所以在想會不會是測序的問題，但是看峰圖都挺好的呀！難道我的基因是多拷貝？

3樓2011-07-06 14:42:15

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lxj341401

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西瓜(金幣+3): good 2011-07-06 17:02:26

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Originally posted by friya0910 at 2011-07-06 14:42:15:
我克一個基因，挑了三個單克隆測序，可是結果都不一樣，但是差得不多，所以在想會不會是測序的問題，但是看峰圖都挺好的呀！難道我的基因是多拷貝？

應該不是測序的問題，現在測序結果還是比較可信的。三個單克隆三個不同結果也可以理解，基因應該是單拷貝的，都連進去了，但連的是不同的基因，是前面實驗的問題。三個里面如果有一個是你要的，就挑取那個單克隆，其他兩個單克隆都不要了，繼續(xù)后面實驗，如果都不是你要的，就挑別的單克隆去測序了或者重新轉化了。

4樓2011-07-06 15:17:20

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friya0910

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Originally posted by lxj341401 at 2011-07-06 15:17:20:
應該不是測序的問題，現在測序結果還是比較可信的。三個單克隆三個不同結果也可以理解，基因應該是單拷貝的，都連進去了，但連的是不同的基因，是前面實驗的問題。三個里面如果有一個是你要的，就挑取那個單克 ...

現在的問題是這三個非常接近的說，而且我也確定不了哪個是我要的，非常糾結呢！

5樓2011-07-06 17:52:54

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lxj341401

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dhd997(金幣+3): 2011-07-06 18:50:19

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Originally posted by friya0910 at 2011-07-06 17:52:54:
現在的問題是這三個非常接近的說，而且我也確定不了哪個是我要的，非常糾結呢！

不知道你三個接近到什么程度？如果這基因是PCR來的，只是幾個堿基不一樣，換個高保真的聚合酶重新弄過；如果你的目的是要表達蛋白的話也無需糾結，三個一起做表達測定活性看看。

6樓2011-07-06 18:48:13

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friya0910

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Originally posted by lxj341401 at 2011-07-06 18:48:13:
不知道你三個接近到什么程度？如果這基因是PCR來的，只是幾個堿基不一樣，換個高保真的聚合酶重新弄過；如果你的目的是要表達蛋白的話也無需糾結，三個一起做表達測定活性看看。

其實我之前在ＤＮＡ上做PCR的時候就發(fā)現這個基因是多拷貝的，現在做表達呢，問題是我送出去測3個樣就測出來三個序列，我怕還有更多的拷貝呢，我打算再送三個樣測測看。其實互相之間堿基差得不到10個吧，翻譯成蛋白也就差兩三個氨基酸。

7樓2011-07-06 20:29:14

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amilie030312

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dhd997(金幣+2): good 2011-07-07 07:42:09

如果相差不大說明你做克隆時用的PCR酶不是高保真酶，估計你被商家忽悠了。如果差距不叫大可以重測一下，有重疊峰的話測序公司一般是會告訴你的，如果酶也換了高保真酶再測序還發(fā)現有不一樣的，那就有可能是不同的剪切子了，恭喜你再做些東西整理一下可以發(fā)個要求不太高的文章了。

8樓2011-07-06 23:30:51

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Originally posted by amilie030312 at 2011-07-06 23:30:51:
如果相差不大說明你做克隆時用的PCR酶不是高保真酶，估計你被商家忽悠了。如果差距不叫大可以重測一下，有重疊峰的話測序公司一般是會告訴你的，如果酶也換了高保真酶再測序還發(fā)現有不一樣的，那就有可能是不同的 ...

怎么說呢，我的目的片段是297bp，然后送三個樣，測出來有三個位點是不一樣的，有的是1、2一樣，3不一樣，有的是2、3一樣，1不一樣；翻譯成蛋白，1和2完全一樣，3號有一個位點和它們不一樣；我剛咨詢了一下公司，說他們的酶的保真性能達到95%以上，不應該是錯配。測序的峰圖也挺好的。選了兩個樣重測以后還是和以前一樣，應該可以排除測序出現錯誤的問題。還有弱弱的問一下，什么叫剪切子不一樣��？

9樓2011-07-07 15:34:15

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Originally posted by friya0910 at 2011-07-07 15:34:15:
怎么說呢，我的目的片段是297bp，然后送三個樣，測出來有三個位點是不一樣的，有的是1、2一樣，3不一樣，有的是2、3一樣，1不一樣；翻譯成蛋白，1和2完全一樣，3號有一個位點和它們不一樣；我剛咨詢了一下公司 ...

不用說了，你被忽悠了，換一家專業(yè)點的公司買酶吧。說吧，你用的啥牌子的酶��？讓大家共同來批判一下引以為戒。
不過也不一定，我覺得第一個和第二個沒有引起編碼改變的倒是可以接受的，是不是同源密碼啊，但第三個不一樣的我估計就是值得討論一下了。