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shizishanshang至尊木蟲 (職業(yè)作家)
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[交流]
測序結(jié)果的疑問
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前面利用CODEHOPE設(shè)計(jì)了簡并引物，克隆一個(gè)基因片段。現(xiàn)在測序結(jié)果已經(jīng)出來，令我很疑惑。 割膠回收后連接PMD18載體后，涂平板，挑單菌過夜搖菌，之后提質(zhì)粒酶切，送去測序。 現(xiàn)在問題來了，同一個(gè)平板出來的克隆，測序結(jié)果不同，有80%左右的相似性。BLAST后都與相關(guān)基因具有比較高的同源性。 現(xiàn)在一共送去了11個(gè)克隆測序，目前粗粗看了一下至少有4個(gè)不同的片段，之間一般是具有80%左右的同源性。 請(qǐng)問這是怎么回事？基因家族？我要克隆的這個(gè)基因是具有基因家族的傳統(tǒng)的，擬南芥等植物里一般有4-8個(gè)基因家族是很正常的。 還是測序問題？ 令外問一個(gè)令我不解的問題，植物的基因組應(yīng)該是固定的吧，那么那么多基因家族，對(duì)應(yīng)的外顯子應(yīng)該不同，怎么能一一對(duì)應(yīng)基因組DNA呢？ 望大家解惑，謝謝！ |
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4樓2011-07-05 10:50:48
thinka
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★ ★ ★ ★
shizishanshang(金幣+1):謝謝參與
silicare(金幣+3, EPI+1): 前提是PCR沒有突變 2011-07-05 12:12:51
shizishanshang(金幣+2): 謝謝啊，看著BLAST結(jié)果頭暈著呢 2011-07-05 17:22:40
shizishanshang(金幣+1):謝謝參與
silicare(金幣+3, EPI+1): 前提是PCR沒有突變 2011-07-05 12:12:51
shizishanshang(金幣+2): 謝謝啊，看著BLAST結(jié)果頭暈著呢 2011-07-05 17:22:40
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肯定不是測序的問題。對(duì)于植物來說最大的可能是因?yàn)榇蟮幕蚣易?也有可能是選擇性剪切.不知道你說得相似性是怎么算出來的,是SNP還是有插入或者確實(shí)的片段？做過blast沒有呢，可以試一下用clustalx或者seqman等比一下看看。 怎么能一一對(duì)應(yīng)基因組DNA呢？這句話沒看明白你是什么意思，你是問如何去對(duì)應(yīng)還是已經(jīng)對(duì)應(yīng)了你不理解為什么？ 你可以通過比對(duì)基因組序列和mRNA序列來分析你這些序列所對(duì)應(yīng)的基因組的結(jié)構(gòu)的，這個(gè)可以幫助你確定他們是基因家族還是選剪以及是如何剪切的。植物的基因組有多倍體。 另外還有個(gè)問題，不知道的模板是DNA還是cDNA. |
2樓2011-07-05 10:39:32
★ ★ ★ ★
shizishanshang(金幣+1):謝謝參與
silicare(金幣+3, EPI+1): 有一定道理 2011-07-05 12:13:39
shizishanshang(金幣+1): 恩，問了一下公司說測序肯定沒有問題，我的片段大約850bp，測通的 2011-07-05 17:23:19
shizishanshang(金幣+2): 已經(jīng)證明是基因家族，全長已經(jīng)得到，既是做熒光定量不好設(shè)計(jì)引物了 2011-10-04 15:15:03
shizishanshang(金幣+1):謝謝參與
silicare(金幣+3, EPI+1): 有一定道理 2011-07-05 12:13:39
shizishanshang(金幣+1): 恩，問了一下公司說測序肯定沒有問題，我的片段大約850bp，測通的 2011-07-05 17:23:19
shizishanshang(金幣+2): 已經(jīng)證明是基因家族，全長已經(jīng)得到，既是做熒光定量不好設(shè)計(jì)引物了 2011-10-04 15:15:03
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測序?qū)Y(jié)果也是有較大影響的，并非樓上說的肯定不是測序的問題。 一般的測序儀在600以內(nèi)保證沒問題，800左右及以上就不準(zhǔn)確了，尤其是技術(shù)不過關(guān)的企業(yè)。 你通過兼并引物擴(kuò)出來的片段我感覺更多的像是基因家族的多個(gè)成員，畢竟他們有著相似度很高的保守區(qū)段，當(dāng)然也不排除其他的可能…… |
3樓2011-07-05 10:45:59
shizishanshang
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我是在NCBI上BLAST的了，通過BLASTN或者BLASTX都與已知的基因同源性比較高。我是用BLAST的里面的兩兩比較確定其相似性的。比如 Score = 663 bits (734), Expect = 0.0 Identities = 705/936 (75%), Gaps = 23/936 (2%) Strand=Plus/Plus Query 1 GAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGATTGGAGTACAAGCAAATCCAAAAGT 60 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 23 GAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGATTGGAGTACAAGCAAATCCAAAAGT 82 Query 61 AATGAACTGGTGAATGAGCATTAAGATGACGGCAGTGTCACGCCAGCCAGTCCTGGAGAG 120 ||| ||||| ||||| ||||| | ||||| ||| | || | | ||||| || | ||| Sbjct 83 AATAAACTGATGAATAAGCATGAGTATGACAGCACTATCTCTGAATCCAGTTCTTGGGAG 142 Query 121 AAGTGAGAAGGCGTTGGAATGATTGAGGAGTTGATCGCCGAATGCCCAGTAGACGGCGGT 180 | |||||| || |||| ||| | || || || || |||||||| || || || | Sbjct 143 CAATGAGAAAGCATTGGCATGGGTAAGAAGCATGTCTCCAAATGCCCAATACACAGCAGA 202 Query 181 GGCTGAGGGAATTGTTAATGTGAAAACGTACAAGGTAGCAAACAGATATATGTACTTGAA 240 || || || | || || || || || || | || || | || ||||| |||||| Sbjct 203 AGCCGATGGCAAAGTCAAGGTTAATACATAAAGTGTCGCCATCAAGTATATCACCTTGAA 262 Query 241 CTTTTGAGGTTTCCACATGGCGTGCATAATCTCCACAGTAACAGCGTGGCCACCAAAAGT 300 ||| || || |||||||| || ||||| ||||| || || ||||| || || ||||| || Sbjct 263 CTTCTGTGGCTTCCACATTGCATGCATGATCTCAACTGTGACAGCATGTCCCCCAAACGT 322 Query 301 GTACAGAATATTGGTAGCGCCAGTGAAGTACAGCACTAGCTTTGTCGGAGCCGAGTGTGA 360 ||| ||||| || ||||| ||||||||||| || || | || || || ||||||| Sbjct 323 GTAGAGAATGTTAGTAGCTCCAGTGAAGTAGAGAACCATTTTAGTTGGGCCCGAGTGCTT 382 Query 361 CACACCTTCAACCTGGCCATGTACAAGGGCGGCAATGGCCATATACCAGGCGGTGTAAGT 420 ||| ||||||||||| ||||| | |||| || |||| | |||||| || || ||||| Sbjct 383 CACTCCTTCAACCTGTCCATGAATTAGGGAAGCTATGGTTAAATACCATGCAGTATAAGT 442 Query 421 GGTCATGCCGAGGCCGAGAAAAGACCAGATTCGGTAGTTATGAAAGGAAGGGATGAACAC 480 ||||| ||||| | ||| ||||| |||| ||||||||| || || || || ||||| Sbjct 443 AGTCATCATAAGGCCAACAAATGACCAAATTCTGTAGTTATGGAATGAGGGAATAAACAC 502 或者，另外的對(duì)比后， Score = 746 bits (826), Expect = 0.0 Identities = 722/928 (78%), Gaps = 0/928 (0%) Strand=Plus/Plus Query 1 AGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGATTGGAGTACAAGCAAATCCAAAAGTAATGAAC 60 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 2 AGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGATTGGAGTACAAGCAAATCCAAAAGTAATGAAC 61 Query 61 TGGTGAATGAGCATTAAGATGACGGCAGTGTCACGCCAGCCAGTCCTGGAGAGAAGTGAG 120 || || ||||||||||| | ||| || |||| || || | ||| || ||| | Sbjct 62 TGATGGATGAGCATTAAAACGACAGCCATGTCTCGGAAGGGTGATTTGGGGAAAAGGGCA 121 Query 121 AAGGCGTTGGAATGATTGAGGAGTTGATCGCCGAATGCCCAGTAGACGGCGGTGGCTGAG 180 || |||||||| ||||| || || || || |||||||| ||||| || | || ||| Sbjct 122 AAAGCGTTGGAGTGATTAAGAAGCATGTCCCCAAATGCCCAATAGACAGCTGATGCCGAG 181 Query 181 GGAATTGTTAATGTGAAAACGTACAAGGTAGCAAACAGATATATGTACTTGAACTTTTGA 240 || | ||| | ||| ||||| || | || || | | |||||| |||||||||||| Sbjct 182 GGCAGTGTCAGTGTCAAAACATAGAGAGTCGCCAGTAAGTATATGGCCTTGAACTTTTGG 241 Query 241 GGTTTCCACATGGCGTGCATAATCTCCACAGTAACAGCGTGGCCACCAAAAGTGTACAGA 300 || |||||||| || ||||| || |||||||||||||| || || ||||| ||||| ||| Sbjct 242 GGCTTCCACATAGCATGCATTATTTCCACAGTAACAGCATGTCCTCCAAATGTGTAGAGA 301 Query 301 ATATTGGTAGCGCCAGTGAAGTACAGCACTAGCTTTGTCGGAGCCGAGTGTGACACACCT 360 || || || || || || || || | || ||||| || || | || ||| ||| ||| Sbjct 302 ATGTTTGTGGCTCCTGTAAAATATAACATCAGCTTGGTTGGGCCTGAATGTTTCACTCCT 361 Query 361 TCAACCTGGCCATGTACAAGGGCGGCAATGGCCATATACCAGGCGGTGTAAGTGGTCATG 420 || ||||||||||| | || || ||||||| | |||||| | |||||||| ||||| Sbjct 362 TCCACCTGGCCATGGAGGAGAGCAGCAATGGTGAGATACCAAGACGTGTAAGTTGTCATC 421 Query 421 CCGAGGCCGAGAAAAGACCAGATTCGGTAGTTATGAAAGGAAGGGATGAACACAGTGGTG 480 ||||||| ||||||||||| |||| |||||| ||||| ||||| ||||| || || || Sbjct 422 ACGAGGCCAAGAAAAGACCAAATTCTGTAGTTGTGAAATGAAGGAATGAAGACTGTAGTT 481 Query 481 GCACAGCAAGCACCAAAAATATAAGTCCATGTTCGCTTATCCAATCGGTCGTTGATGTAG 540 ||||||||||| || || || |||||||| || | ||| |||| ||| || ||||| -------------------- 不能上傳圖片，排列的很不齊啊。 我是用CDNA作模板的，還么有用DNA作模板擴(kuò)。 |
5樓2011-07-05 17:19:12
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