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yzfjfx1986

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[交流] 【求助/交流】Thrombin protease切GST問(wèn)題

我目的蛋白-GST為36分子量，目的蛋白10kDa左右，GST26kDa，用10u 20u 40u 去切GST，我前面用10u切了15小時(shí)，切不出目的蛋白，用GSH去還原膠，跑SDS-PAGE,果然還在膠上，應(yīng)該說(shuō)明沒(méi)切下來(lái)，因此我用20u 40u去切20個(gè)小時(shí)（前面短時(shí)間2h，3h也切過(guò)，效果一樣不好），這次有些短的條帶出來(lái)了，但仍找不見(jiàn)目的條帶，因此想問(wèn)下用幾U和多少時(shí)間去切是最佳的，希望哪位高手可答復(fù)下，急啊

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1樓 2011-03-04 20:19:11

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brightfuture01

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Originally posted by yzfjfx1986 at 2011-03-06 12:08:39:
我凝血酶來(lái)自牛血清，要求20-22度，也在這個(gè)溫度下切了，4度沒(méi)試過(guò)，根據(jù)說(shuō)明書(shū)應(yīng)該是不可以的，酶活會(huì)很低，反正切了收集的上清中沒(méi)找到要的目的條帶，我繼續(xù)用GSH去還原剩下的含GST或GST-雜蛋白的膠（中間用P ...

好詭異啊。。。

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4樓2011-03-06 12:14:21

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brightfuture01

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★ ★
yzfjfx1986(金幣+1):謝謝參與
lstt09nk(金幣+1): 感謝交流 2011-03-06 15:01:06

試過(guò)換溫度么？我們有的時(shí)候4度切不掉就20度或者37度切。不知道你用的酶和我們用的一樣不。我們的用量一般是按體積來(lái)算的， 1-2U/ml。

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2樓2011-03-04 21:11:24

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yzfjfx1986

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Originally posted by brightfuture01 at 2011-03-04 21:11:24:
試過(guò)換溫度么？我們有的時(shí)候4度切不掉就20度或者37度切。不知道你用的酶和我們用的一樣不。我們的用量一般是按體積來(lái)算的， 1-2U/ml。

我凝血酶來(lái)自牛血清，要求20-22度，也在這個(gè)溫度下切了，4度沒(méi)試過(guò)，根據(jù)說(shuō)明書(shū)應(yīng)該是不可以的，酶活會(huì)很低，反正切了收集的上清中沒(méi)找到要的目的條帶，我繼續(xù)用GSH去還原剩下的含GST或GST-雜蛋白的膠（中間用PBS洗下），結(jié)果提下來(lái)的居然在10左右出現(xiàn)了一個(gè)條帶，讓我感到非常奇怪，我要的那個(gè)條帶居然在Thrombin后留在了膠了，而且這個(gè)蛋白不可能是與GST結(jié)合的（遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于26kDa），它怎么會(huì)留在膠上？？

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3樓2011-03-06 12:08:39

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郜珊

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★
yzfjfx1986(金幣+1): 謝謝參與

你好好查一下，你的目的蛋白的序列中是否有凝血酶酶切位點(diǎn)，如果有的話，可能凝血酶把目的條帶切下來(lái)一部分。

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5樓2013-01-23 12:52:19

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