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wcx蝸牛無(wú)蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
酶切問(wèn)題
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本人前期已近在T載體（買(mǎi)的由PUC18改造而成的）引入帶有EcoRI和NcoI的目的片段，現(xiàn)在需再往上連片段。用EcoRI和NcoI雙酶切之前構(gòu)建好的T載體，電泳發(fā)現(xiàn)沒(méi)有條帶。接著我在體系中不加酶，加同樣的buffer對(duì)照,電泳發(fā)現(xiàn)也沒(méi)有條帶�？梢杂猛瑯拥腅coRI和NcoI酶和buffer酶切pcr我要連接上的目的片段可以很好酶切。酶切質(zhì)粒的量是足夠的，5道中只上5ul質(zhì)�？梢砸�(jiàn)條。雙酶切是20ul質(zhì)粒，3ulbuffer,1ul EcoRI,1ulNcoI,30ul體系。電泳時(shí)兩個(gè)酶切體系60ul在一個(gè)孔道里電泳的，不見(jiàn)條帶。如果說(shuō)是buffer降解我的質(zhì)粒，可是酶切pcr產(chǎn)物卻未有問(wèn)題。如果說(shuō)沒(méi)有切開(kāi)，電泳應(yīng)該有條帶。 求高人指點(diǎn)。 圖片說(shuō)明： 從左往右，第2道1Kb marker,第3道雙酶切T載體；第四道不加酶的對(duì)照；第5道原始T質(zhì)粒；第六道空；第7道D2000marker;第8道pcr目的片段；第9道雙酶切pcr目的片段 從左往右，第2道1Kb marker,第3道雙酶切T載體；第四道不加酶的對(duì)照；第5道原始T質(zhì)粒；第六道空；第7道D2000marker;第8道pcr目的片段；第9道雙酶切pcr目的片段 [ Last edited by 1949stone on 2012-3-17 at 12:00 ] |
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sunwei57
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7樓2012-03-17 17:01:30
【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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感覺(jué)從你的圖中反應(yīng)你先前構(gòu)建的載體未成功。要不就是構(gòu)建好的載體質(zhì)粒都未提取出來(lái)，要不然3，4泳道怎么什么都沒(méi)有。目的片段中是否含有其它兩個(gè)常見(jiàn)的酶切位點(diǎn)，先把你認(rèn)為構(gòu)建好的載體提質(zhì)粒，再用其它兩個(gè)酶來(lái)切切看，可以看酶本身有木有問(wèn)題，同時(shí)也可以看你的質(zhì)粒中到底有木有你以前連接上去的片段。泳道里什么都沒(méi)有，我覺(jué)得最大的可能還是壓根兒都沒(méi)提出質(zhì)粒。些許拙見(jiàn)，僅供參考 |
8樓2012-03-19 15:12:55
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9樓2012-03-20 09:29:11
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西瓜: 金幣+2, 沒(méi)錯(cuò)，實(shí)驗(yàn)就要一步一步來(lái)~歡迎常來(lái)哈^_^ 2012-03-20 12:05:34
西瓜: 金幣+2, 沒(méi)錯(cuò)，實(shí)驗(yàn)就要一步一步來(lái)~歡迎常來(lái)哈^_^ 2012-03-20 12:05:34
做實(shí)驗(yàn)就是這樣，一點(diǎn)點(diǎn)小問(wèn)題就可能影響很大，特別是平�？此谱隽撕芏啾榈膶�(shí)驗(yàn)，總覺(jué)得不會(huì)出什么錯(cuò)誤，其實(shí)不然。以前我們好多同學(xué)提完質(zhì)粒都不檢測(cè)質(zhì)粒是否提出來(lái)了，濃度是否足夠的，這樣很容易給后續(xù)試驗(yàn)帶來(lái)麻煩的，實(shí)驗(yàn)一旦出問(wèn)題然后再去找原因就難了，一個(gè)結(jié)果可能是N種原因?qū)е碌模纯嗔�。雖然不干本行了，但還是偶爾上論壇看看有沒(méi)有什么可幫忙的，工作中沒(méi)能利用本專(zhuān)業(yè)知識(shí)，在論壇里發(fā)揮點(diǎn)余熱， |
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wcx蝸牛10樓2012-03-20 11:12:27
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