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[交流] 【求助/交流】關(guān)于RNA的問題

1.RNA電泳需要注意哪些，需要什么內(nèi)參嗎，我想要看下RNA提取的質(zhì)量情況
2.如何去除RNA的DNA污染呢，我要進一步做RT-PCR,然后擴增目的條帶，如果有DNA污染，就都能擴出來了

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1樓 2011-03-16 09:24:02

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mafang68

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lstt09nk(金幣+1): 感謝參與 2011-03-16 09:47:27
tutufei(金幣+1): 謝了 2011-03-21 21:22:37

RNA質(zhì)量可以測OD260（好像是，記不清了）值，在1.8-2.0間好
不是有好幾步洗的過程么，哪有那么多DNA啊

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2樓2011-03-16 09:38:26

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tangchaoxi

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tutufei(金幣+1): 不是，手提哦 2011-03-21 21:23:28

引用回帖:

Originally posted by tutufei at 2011-03-16 09:24:02:
1.RNA電泳需要注意哪些，需要什么內(nèi)參嗎，我想要看下RNA提取的質(zhì)量情況
2.如何去除RNA的DNA污染呢，我要進一步做RT-PCR,然后擴增目的條帶，如果有DNA污染，就都能擴出來了

RNA電泳要用新的膠和新的電泳緩沖液，電泳槽什么的洗干凈就可以了，RNA的質(zhì)量主要還是RNA提取過程決定的。像樓上說的那樣就行啦。你是用試劑盒嗎？

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3樓2011-03-16 09:41:55

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nininini

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翱宇(金幣+1): 不錯，謝謝交流，DNA的消化應(yīng)該還有一步抽提，補加DEPC水到400ul，以氯仿抽提就行了 2011-03-16 23:57:21
tutufei(金幣+8): 謝謝 2011-03-21 21:35:36

電泳如樓上所說應(yīng)該沒問題，當(dāng)然用ＤＥＰＣ處理過的水制膠及緩沖液應(yīng)該會更好～～ＲＮＡ質(zhì)量可以通過OD260/280，比例在1.8~2.再就是電泳看圖了，28s/18s或23s/16s大約為2:1,
除DNA如果怕不干凈的話可以用DNase消化一下，再除下蛋白，一般應(yīng)該沒問題，可以用RNA做下PCR驗證是否有DNA污染

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4樓2011-03-16 10:18:26

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tutufei

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引用回帖:

Originally posted by tangchaoxi at 2011-03-16 09:41:55:
RNA電泳要用新的膠和新的電泳緩沖液，電泳槽什么的洗干凈就可以了，RNA的質(zhì)量主要還是RNA提取過程決定的。像樓上說的那樣就行啦。你是用試劑盒嗎？

手提的，用別人實驗室的試劑（汗�。�，人家用biozol試劑處理植物，不知道能不能用來處理細(xì)菌，聽說真核的mRNA比原核的穩(wěn)定是嗎，文獻上有說細(xì)菌mRNA半衰期就幾分鐘，看人家提植物RNA很粗獷啊，跟提一般的DNA沒兩樣，跑電泳也是跟一般的一樣，哎，好不放心，還有有試劑盒說明書標(biāo)明細(xì)菌用量1*107--5*108次方個是什么概念？好多問題啊，麻煩大家啦

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5樓2011-03-16 23:51:05

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zhangby2002

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tutufei(金幣+1): 謝了 2011-04-24 18:50:29

引用回帖:

首先RNA提取時特別注意要防止污染，你可以用核算定量儀看看OD值呀。一般2左右（+—0.1），可以電泳檢測一下，主要看有帶嗎？不需要內(nèi)參吧，你可以用B-actin參照一下。電泳結(jié)果你可以看出，一條帶比較干凈。做反轉(zhuǎn)錄試驗時做好要做去除RNA中DNA的污染這步，加DNA酶1，DNAbuffer,DEPC,然后再加EDTA.

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6樓2011-03-19 17:06:28

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wangleisdnu

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tutufei(金幣+5): thank you very much! 2011-03-21 21:32:42

引用回帖:

Originally posted by tutufei at 2011-03-16 23:51:05:
手提的，用別人實驗室的試劑（汗！），人家用biozol試劑處理植物，不知道能不能用來處理細(xì)菌，聽說真核的mRNA比原核的穩(wěn)定是嗎，文獻上有說細(xì)菌mRNA半衰期就幾分鐘，看人家提植物RNA很粗獷啊，跟提一般的DNA沒兩 ...

Trizol can be used to isolate RNA from E coli 107-8 means od600 ---1-10
normaly 1 ml od600 =1 means you have 107 cells
everything should be new and freshly prepared,
I have more experience in RNA, if you have more questions just contact me

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7樓2011-03-21 19:03:47

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wuw579

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1、最好用變性膠可以上網(wǎng)查
2、提取時加入RNase-free 的DNaseI

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8樓2011-03-21 20:36:43

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tutufei

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Originally posted by nininini at 2011-03-16 10:18:26:
電泳如樓上所說應(yīng)該沒問題，當(dāng)然用ＤＥＰＣ處理過的水制膠及緩沖液應(yīng)該會更好～～ＲＮＡ質(zhì)量可以通過OD260/280，比例在1.8~2.再就是電泳看圖了，28s/18s或23s/16s大約為2:1,
除DNA如果怕不干凈的話可以用DNase消 ...

ＲＮＡOD260/280是用普通的紫外分光光度計檢測嗎？實驗室的比色皿最少容量是1ml，而提取的RNA量很少的啊

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9樓2011-03-21 21:30:51

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ls2046

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東西搞干凈點，主意衛(wèi)生，按操作進行沒問題的，呵呵，，，

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10樓2011-03-21 22:29:25

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lxjwishes

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消化一下DNA

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11樓2011-03-22 09:49:16

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Eva2009

禁蟲 (初入文壇)

tutufei(金幣+1): 謝了 2011-04-24 18:48:40

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12樓2011-03-22 11:17:48

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nininini

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tutufei(金幣+1): 謝謝 2011-04-24 18:48:30

引用回帖:

Originally posted by tutufei at 2011-03-21 21:30:51:
ＲＮＡOD260/280是用普通的紫外分光光度計檢測嗎？實驗室的比色皿最少容量是1ml，而提取的RNA量很少的啊

如果提取的濃度夠大的話可以進行適當(dāng)稀釋~~有40微升的比色皿，不過我沒用，就將RNA溶液稀釋了15~30倍，使得讀數(shù)在0.1~0.8，提取的RNA如果量太低就不合適用這種方法了，直接電泳估計濃度好了~

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13樓2011-03-23 10:01:51

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szylnl

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tutufei(金幣+2): 謝謝 2011-04-24 18:47:26

我有個方法或許可以在電泳時防止降解，膠新配，緩沖液用DEPC-水配，這些是必須的，我每次陪完膠，加好緩沖液之后，都將電泳槽放進超凈臺里用紫外照2個小時，這樣基本上沒有降解，5srRNA看不見，28是18的兩倍左右。DNA污染的問題是聽麻煩的，尤其是做RT的時候，所以還是要加DNA酶。

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14樓2011-03-23 10:27:50

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