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huangqihong鐵蟲 (小有名氣)
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[交流]
【求助/交流】有人做過脈沖場電泳嗎 已有6人參與
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請教各位有沒有做過脈沖場電泳，求比較詳細的protocol。 另外其中對菌的生長時期、收集菌體的數(shù)量、酶切位點選擇以及酶切時間長度等問題想了解更多一點。有沒有不酶切處理，包埋后直接電泳的，多謝各位指點？ |
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西瓜
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脈沖場凝膠電泳(PFGE)實驗 作者：牛建章 來源：生物秀 時間：2007-12-3 【實驗?zāi)康摹?br /> 了解脈沖凝膠電泳的工作原理，并學習和掌握有關(guān)的操作技術(shù)。 【實驗原理】 大分子DNA(一般長度超過20kb，在某些情況下，超過40kb)在電場作用下通過孔徑小于分子大小的凝膠時，將會改變無規(guī)卷曲的構(gòu)象，沿電場方向伸直，與電場平行從而才能通過凝膠。此時，大分子通過凝膠的方式相同，遷移率無差別(也稱“極限遷移率”)，不能分離。脈沖場凝膠電泳技術(shù)解決了這一難題，它應(yīng)用于分離純化大小在10～2000kb 之間的DNA 片段。這種電泳是在兩個不同方向的電場周期性交替進行的，DNA分子在交替變換方向的電場中作出反應(yīng)所需的時間顯著地依賴于分子大小，DNA 越大，這種構(gòu)象改變需要的時間越長，重新定向的時間也越長，于是在每個脈沖時間內(nèi)可用于新方向泳動的時間越少，因而在凝膠中移動越慢。反之，較小的DNA 移動較快，于是不同大小的分子被成功分離。在許多實用的PFGE 方法中，倒轉(zhuǎn)電場凝膠電泳是最簡單最常用的方法(FIGE)。通過把一個在不同電場方向有不同脈沖方式的脈沖電場加在樣品上，倒轉(zhuǎn)電場凝膠電泳(FIGE)設(shè)備能把大小范圍在10～2000kb 的DNA 片段分開。FIGE也可通過重新確定一個對準完全固定好角度的電場，這樣會進一步擴展其分離極限達到10Mb。 【儀器、材料與試劑】 1.制備DNA 樣品所需材料 1)TEN 緩沖液(0.1mol/LTris，pH7.5；0.15mol/LNaCl；0.1mol/LEDTA)。 2)Seaplaque 瓊脂糖(EC 緩沖液中濃度為2%)。 3)EC 緩沖液(6mol/LTris，pH7.5；lmol/L NaCl；0.5% Brij58；0.2%脫氧膽酸鹽(Deoxycholate)；0.5%十二烷基肌氨酸鈉(Sarcosyl)。（生物秀實驗頻道 www.bbioo.com） 4)ESP 緩沖液(0.5mol/L EDTA，1%十二烷基肌氨酸鈉，lmg/mL 蛋白酶K)。 5)溶葡萄球菌素(5mg/mL)。 6)RNase(10mg/mL)。 7)膠模(由常規(guī)瓊脂糖凝膠制得或購買成品)。 8)苯甲基橫酰氟(PMSF)(17.4mg/mL 于乙醇中)。 9)0.5μg/mL 溴化乙錠 2.分離、純化大的DNA 片段所需材料 1)紫外遞質(zhì)。 2)10mg/mL tRNA。 3)5mol/L NaCl。 4)苯酚/氯仿。 5)3mol/L NaAc，pH5.2。 6)95%乙醇。 3.設(shè)備 1)TBE 緩沖液。 2)Seakem HGT 瓊脂糖。 3)Wide Mini-Sub Cell 凝膠電泳設(shè)備。 4)變速泵或蠕動泵(Bio-Red Laboratory)。 5)IBI FIJI 600 HV 程序性開關(guān)設(shè)備。 6)緩沖液冷卻循環(huán)器(Fotodyne ， New Britain ，WI) 或Mini Chiller(Bio-Rad Laboratory)。 【實驗步驟】 1.脈沖電場凝膠電泳的DNA 樣品的制備 為避免大分子DNA 在提取過程中斷裂，細胞需在瓊脂糖凝膠塊中進行原位裂解，在本實驗中，我們使用金黃色葡萄球菌(StapHylococcus aureus)作為例子。 1)取100mL 對數(shù)生長期金黃色葡萄球菌細胞于4℃，5000g 離心5min。 2)用20mL TEN 緩沖液沖洗沉淀，同樣條件離心5min。之后用10mL EC 緩沖液使細胞懸浮。 3)取1.5mL 細胞樣品與相同體積含2%SeaPLaque 瓊脂糖的EC 緩沖液迅速混合混勻并等分流溶液至封閉的模塊中于4℃凝固，混合前加熱至瓊脂糖熔解并冷卻至50℃。 4)對于每一個菌株，需要15～20 個凝膠塊，將它們放至含有30～45μg/mL RNase(50mL 的10mg/mL 的RNase)的10mL EC 緩沖液中，于37℃振搖過夜。 5)去掉裂解緩沖液，換為10mL ESP 緩沖液于50℃輕度振搖溫育48h。 6)將凝膠塊放在10mL 含有174μg/mL 苯甲基磺酰氟(PMSF)的TE 緩沖液中，室溫溫育4h(2h 換液一次)，以滅活ESP 中的蛋白酶K。 7)用TE 清洗瓊脂塊6h(2h 換液一次)，置于TE 中4℃保存。 2.限制酶消化 提高PFGE 的分辨率取決于100～1000kb 片段電泳結(jié)果的重復(fù)率，它與酶切關(guān)系密切，可在瓊脂糖凝膠塊中使用合適的內(nèi)切酶消化。（生物秀實驗頻道 www.bbioo.com） 1)25μL10×反應(yīng)緩沖液，30U 限制酶，加雙蒸水至250μL 混勻。 2)取一個凝膠塊置其中，合適溫度下溫育過夜(按內(nèi)切酶要求)后，用TE 緩沖液洗滌并貯存。 3.應(yīng)用PFGE 對樣品DNA 進行分析 1)用0.5×TBE 緩沖液制備一個0.8%SeakemHGT 瓊脂糖凝膠，膠的厚度盡量與樣品凝膠塊相符。若用Wide Minisub Cell 進行電泳的話，50mL 該溶液即可。 2)膠凝后，小心移去樣品梳。將凝膠塊用小刀切成與加樣孔一致的大小，將樣心地插入加樣孔，避免產(chǎn)生氣泡。(若樣品在溶液中，以l:1 的比率與50℃2%Seaplaque 瓊脂糖相混合，迅速注入加樣孔中)。 3)把膠放入電泳槽內(nèi)，加緩沖液，剛好覆蓋膠的表面即可，緩沖液事先14℃冷卻。 4)將電泳槽和一個連著穩(wěn)壓電源的程序性開關(guān)設(shè)備相連。打開電源，調(diào)節(jié)蠕動泵到適當流速(5～10mL/rain)或打開變速泵至40。 5)通過計算機啟動極性轉(zhuǎn)換程序。大于50kb 的限制性片段在1.2s 和0.4s 正向和反向的電脈沖下得以分離，時間一般為3.5h 或更長。小于50kb 的限制性片段在0.4s正向和0.2s 反向的電脈沖(比率為2:1)下得以分離，時間為3～5h。 6)在0.5μg/mL 溴化乙錠中進行染色并拍照。 4.分離、純化大的DNA 片段 1)凝膠染色、分析后，在目的帶前(靠近正極處)切一個0.25cm2左右的槽，注入0.8%Seaplaque瓊脂糖，使之凝固。 2)重新打開極性轉(zhuǎn)換開關(guān)，用紫外遞質(zhì)檢測DNA的遷移，當目的帶進入Seaplaque凝膠中時，關(guān)閉開關(guān)，切下目的帶，移至1.5mL EP 管中。 3)加入2μL 的tRNA，30μL 5mol/L NaCl，370μL 蒸餾水，在65～70℃之間，化膠并保溫10min。 4)苯酚/氯仿500μL 抽提兩次。 5)用2.5 倍體積95%乙醇和1/10 體積NaAc(3mol/L，pH5.2)于-70℃10min 沉淀水相。再用70%乙醇洗兩次并將沉淀溶于TE 緩沖液中。 【注意事項】 1.換緩沖掖時盡可能小心不要碰壞瓊脂凝膠。 2.PMSF 是一個強烈的蛋白酶共價抑制劑，即有毒又揮發(fā)，操作時應(yīng)在通風櫥中進行。 3.用蛋白酶K 包埋的材料時50℃溫育時間很長(24～48h)，有些學者提出如此長時間不必要(Mortimer et al.1990)，且可能造成高分子質(zhì)量DNA 降解。在實驗中可視情況而定。 4.瓊脂糖凝膠塊在TE(pH7.6)中4℃可存放數(shù)年，如在0.5mol/L EDTA 中可存放更長時間。 5.一些高壓電源并不適合脈沖電場凝膠電泳，因為這些電源設(shè)計時均帶有保護電路，它可以檢測到負載的突然降低并且引發(fā)外加電源自動關(guān)閉。 6.由于電壓較高，就會產(chǎn)生熱量，為了保證溫度為14℃，需要一些冷卻設(shè)備(緩沖液冷卻循環(huán)器或MiniChiller)。此外，把電泳系統(tǒng)放在一個敞口的冰盒中也可保持恒溫。（生物秀實驗頻道 www.bbioo.com） 來源：實用分子生物學實驗指南 |
2樓2011-03-24 18:13:53
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