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“彗星”分析法在放射生物學中的應用 來源：廣東醫(yī)學雜志 點擊數(shù)：196 更新時間：2007-4-25 文章錄入：Admin “彗星”分析法在放射生物學中的應用 賀玉香 綜述 夏云飛 審校 中山大學腫瘤防治中心放療科(廣州 510060) “彗星”分析法（comet assay）又叫單細胞凝膠電泳（single cell gel eletrophoresis, SCGE）或微凝膠電泳，是一種比較理想的單細胞水平檢測哺乳類有核細胞DNA損傷的新技術。由Ostling等［1］1984年首次提出，后經Singh等［2］逐漸改進。現(xiàn)主要分為中性SCGE和堿性SCGE。其原理如下：去污劑或高鹽裂解溶液破壞細胞膜，使得95%以上的蛋白質及細胞內其他成分滲出膜進入溶解液，DNA由于相對分子質量大而留在原位。電泳時小的DNA斷片在電場作用下移出細胞核。經溴乙啶染色后在紫外線(uv)照射下發(fā)出熒光，每個受損的細胞均呈現(xiàn) “彗星”外觀，明亮的頭部為細胞核，一系列的DNA斷片組成“彗尾”。未受損的細胞只有“彗核”而無“彗尾”。DNA斷片遷移的距離與DNA斷片分子質量和電荷數(shù)相關，DNA斷片越多、越小，“彗尾”越長，又因熒光染料與DNA的結合是特異性的，因此，通過測定 “彗星”尾部長度和熒光強度可推測DNA鏈斷裂情況。如為中性裂解液加上50 ℃的處理只能破壞DNA超螺旋結構，而DNA雙螺旋結構保存完好，只有小的雙鏈片段在電場作用下移出細胞核，形成 “彗星”尾部，故主要用于DNA雙鏈斷裂的檢測。而堿性SCGE中用堿性裂解液（pH>123）處理細胞，不但使細胞內蛋白成分更徹底地分離，也有利于DNA雙螺旋破壞和單鏈片段移行，故用于檢測DNA單鏈斷裂。 此法的突出優(yōu)點是靈敏度高。它可以測出每1657×10－17 kg中01個DNA的斷裂，甚至檢出自然光照體外淋巴細胞1 h引起的DNA損傷［3］。故可研究低劑量下的生物效應。其次，它能對單個細胞進行分析，故適用于體內、體外、不同實驗室、不同細胞的研究。此外，此法還具有所需細胞樣本數(shù)少（<10 000 個）、無需同位素標記、快速、簡便、經濟等優(yōu)點。但是，此方法也存在一定的局限性。最為突出的是用于測量DNA損傷的幾個重要參數(shù)不可能標準化［4］。目前測量的指標較多，主要有尾長、尾力矩、尾部DNA百分數(shù)、尾慣量等，但每一指標的應用均有它的局限性。尾力矩為現(xiàn)常用的較靈敏指標。另一個問題是 “彗星”圖像有可能被飽和。此外，SCGE實驗結果還受電泳的電壓及時間、堿化處理條件及細胞數(shù)等多個因素的影響。因此，在嚴格控制影響因素后，才能使SCGE在檢測中發(fā)揮優(yōu)勢。近年該實驗已廣泛用于放射生物學、遺傳毒理、生物監(jiān)測及腫瘤發(fā)病機制等多個領域。筆者著重介紹該技術在放射生物學領域的應用。 1應用 11檢測各種輻射所致的DNA損傷單鏈斷裂是DNA輻射損傷的最敏感指標，雙鏈斷裂是引起生物學效應的主要原因。不同品質的射線所致的損傷類型不同，如高LET射線引起雙鏈斷裂為主，低LET射線以致單鏈斷裂為主，而uv以引起堿基損傷為主。隨著射線LET的升高，單鏈斷裂減少，雙鏈斷裂增多。故可以通過檢測DNA損傷的不同類型來評價射線的生物學效應。 111DNA單、雙鏈斷裂堿性SCGE是檢測DNA單鏈斷裂最靈敏的指標［5］，通常用SCGE測到的DNA斷裂與劑量呈線性關系。取射線處理后的標本在 ４*!℃ 條件下操作，直到熒光顯微鏡觀察。其目的是在低溫條件下抑制DNA修復的酶活性，使斷裂的DNA能得以保留至最后分析。根據(jù)“彗星”圖像出現(xiàn)的情況就能準確測到某種射線是否造成DNA斷裂及斷裂情況。在中性環(huán)境下裂解、電泳后所測到的“彗星”圖像則可代表DNA雙鏈斷裂情況，因為雙鏈斷裂比單鏈斷裂出現(xiàn)的機率少25～40倍，故所用射線的劑量應大，并且要用嚴格的裂解液，檢出雙鏈斷裂的最少劑量是5 Gy。Olive等［6］證實了5～300 Gy的范圍內“彗星”法檢測到的雙鏈斷裂也與劑量呈線性反應關系。 112檢測DNA-DNA鏈間交聯(lián)、鏈內交聯(lián)及DNA-蛋白質交聯(lián)（DPC）輻射損傷致DNA鏈間交聯(lián)不如化學損傷多，但也能發(fā)生。其檢測方法有兩種：一是延長電泳時間，使對照組出現(xiàn)“彗星”影像，而處理組DNA遷移距離反而短于對照組。此法可檢出多種交聯(lián)形式。其二，處理組與對照組都加一標準的斷裂劑，這樣交聯(lián)的存在就會減少后者所致的DNA斷片釋放，與對照組相比“彗星”尾部減少的長度等指標與交聯(lián)的量成正比。但是如所用射線引起的DNA交聯(lián)少而斷裂多，則用此法不太實際。因為射線所致的DNA 鏈斷裂會產生一個很高的“彗星”背景而不利于判斷［4］。 有實驗研究發(fā)現(xiàn)小牛胸腺脫氧核糖核蛋白（DNP）在uv或γ射線照射以后，其中DNA中不能被提取的部分隨著照射劑量的增加而增加，但用胰蛋白酶處理，則觀察不到這部分DNA。因為uv和γ射線照射導致了DNA和核蛋白交聯(lián)，影響了DNP中DNA的提出，胰蛋白酶能裂解DNA與蛋白質之間的共價健，消化DNP中的蛋白質部分，所以全部的DNA都能被提出。故SCGE測定DPC是根據(jù)加入蛋白酶前后DNA遷移距離的變化來計算交聯(lián)率，從而對射線引起DPC的能力進行評價。Marty等［7］用SCGE研究p53基因對細胞增殖作用時發(fā)現(xiàn)p53缺陷型小鼠精子細胞DNA斷裂數(shù)目遠低于野生型，推測可能由于p53基因缺陷引起DNA交聯(lián)。 uv能形成較多的DNA鏈內交聯(lián)（嘧啶二聚體形成）。細胞內源性酶對損傷DNA灶進行切除及再連接修復，與此過程相吻合的是在SCGE中可相應的觀察到“彗尾”的出現(xiàn)與消失。當然DNA鏈被切開后再連接的速度非�？�，故在加入核酸內切酶的同時加入抑制劑或使DNTPs漏出胞核，以阻斷切除修復中DNA合成與再連接，這才可檢測到DNA的細微損傷。例如用t4-uv特異性核酸內切酶可監(jiān)測嘧啶二體的切除。 1．2細胞死亡的檢測放射治療中，如果輻射引起的DNA雙鏈斷裂等得不到修復，則細胞最終走向凋亡或壞死。凋亡細胞的特征性改變?yōu)楹怂醿惹忻冈诤诵◇w間將DNA分裂成核小體大�。�180～200 bp）或其倍數(shù)的碎片。在SCGE電泳過程中DNA遷移距離數(shù)倍于正常細胞［8］。因大量的DNA斷片遷移形成脫離“彗頭”的巨大“彗尾”，二者很容易區(qū)分。因不需要再經歷變性，中性SCGE和堿性SCGE均適用�？捎糜诳焖贆z測凋亡細胞的比例及DNA斷片的大小，因此在樣本量少時SCGE是代替流式細胞儀檢測凋亡的好方法。壞死細胞DNA斷片大小雖不規(guī)則，但在電場的作用下亦可形成巨大“彗尾”，容易與正常細胞鑒別，但很難與凋亡細胞區(qū)分。 1．3預測放射敏感性以往常用于預測腫瘤放射敏感性的技術主要是存活曲線，但早期的存活曲線在初始部分（劑量小于3 Gy）時不夠敏感，而這部分在放療上卻是最重要的，“彗星”法可檢出低至01 Gy的輻射損傷，因此可以彌補這點不足，還可以在低劑量階段解決腫瘤的輻射異質性問題。故可以通過在放療前先取活組織標本在體外放療2 Gy，用SCGE法測出DNA損傷程度，再在 37*!℃ 孵育測得其修復損傷的能力而該腫瘤對射線的敏感性。為臨床選擇治療方法提供依據(jù)。 1．31乏氧分數(shù)的測定因為氧具有很強的電子親和力，故在放射治療中起著親電子性增敏劑的作用。射線在氧合好的細胞中產生的DNA損傷3～4倍于乏氧細胞。故可以用“彗星”法測出放療以后乏氧尾矩與有氧尾矩之比，得出乏氧分數(shù)。Olive等［９］發(fā)現(xiàn)以腫瘤治愈為終點指標與用“彗星”法測得的乏氧分數(shù)有良好的相關性。他們同時用此法檢測了73例姑息放療的轉移性腫瘤，其乏氧分數(shù)波動在000至067，平均015。并比較了現(xiàn)有的幾種測乏氧細胞的方法，提示“彗星”法是測中央氧壓<10 mmHg的腫瘤乏氧分數(shù)最敏感的方法［10］。 但它的缺陷是要求在照后快速取材，否則單鏈修復會影響結果。且不能在治療前測得乏氧分數(shù)。 1．32細胞的內在敏感性影響內在敏感性的主要因素是細胞修復DNA 損傷的能力不同。SCGE檢測DNA修復能力的原理在于：細胞經受試物作用以后進行孵育（DNA進行修復），比較孵育前后DNA 遷移的變化可得出DNA的修復能力。這方面已有大量的文獻報道。呂長興等［11］用堿性SCGE測出鼻咽癌高分化鱗癌細胞系比肺腺癌細胞系半修復時間長，這與CNE-1對放療更敏感（D0值小）有較好的對應關系；Olive等［12］測得人淋巴細胞TK6與鼠的L178Y-R細胞比CHO，V79修復明顯減慢而出現(xiàn)較多的殘余損傷，從而認為TK6與L178Y-R細胞系存在修復缺陷。故SCGE法可發(fā)現(xiàn)修復缺陷細胞系，預測不同腫瘤的修復能力。大量實驗提示乳腺癌患者“彗星”法測得的成纖維細胞和淋巴細胞DNA損傷與修復能力和臨床皮膚放射反應存在良好的相關性［13,14］。與以往的檢測DNA修復實驗如：核酸探針法、病毒探針法比較，具有簡單、快速、靈敏和不需同位素標記等優(yōu)點。 1．33細胞周期在“彗星”檢測中，由于熒光染料與DNA 的結合是特異的，根據(jù)熒光強度可以對DNA進行定量，從而鑒別不同周期、不同倍體的細胞。以往的一系列檢測均未能測得處于不同細胞周期的細胞對同一處理存在DNA鏈斷裂發(fā)生和重接率的差異。Olive等［12］用堿“彗星”分析DNA 損傷和細胞周期位置發(fā)現(xiàn)，測量單鏈斷裂的“彗尾”和半修復時間因細胞所處的細胞周期不同而不同。G1期的細胞半修復時間(37 s)較其他期細胞(51 s)短，故認為“彗星”法能檢測出處于不同周期的細胞對射線修復能力的細小變化。S期的細胞用“彗星”法檢測鏈斷裂的敏感性均較其他期低，這是因為復制產生的問題。S期DNA復制時形成的復制叉在堿性裂解液或電泳液時形成單鏈斷裂，所以增加了S期細胞的損傷背景。 134低劑量放射超敏感性的預測低劑量超敏感性即有些細胞在受到<50 cGy照射存在敏感性增高的現(xiàn)象，這使得靶區(qū)外正常組織的生物效應將高于以前的預測值。因傳統(tǒng)的克隆記數(shù)法不能評價<100 cGy的肩區(qū)的存活變化，而SCGE具有高度敏感性，故可用于探測此現(xiàn)象。以便常規(guī)照射或三維適形放射治療時，盡量考慮野外正常組織的低劑量超敏問題以避免出現(xiàn)較嚴重的損傷。 由于“彗星”法能檢測出上述影響放射敏感性的因素，從而鑒別對射線敏感或抗拒的亞細胞群在放射生物學領域有重要的應用價值。近年來隨著ATM，KU，XRCC等DNA修復相關基因功能的闡明，通過此途徑修飾細胞的輻射敏感性成為可能，而SCGE成為不可缺少的檢測工具。 14探討輻射致突變、致癌、致死效應的機制由于SCGE可靈敏的檢測出各種DNA損傷與修復，故可用于探討輻射致突變、致癌、致死效應具體是因為DNA雙鏈斷裂、斷鏈重接失真，還是因為堿基損傷或鏈間交聯(lián)等引起。用SCGE檢測著色性干皮�。╔P）患者經uv照射后的淋巴細胞時，發(fā)現(xiàn)其“彗星”細胞百分率較正常人淋巴細胞經uv照射后明顯減少，提示切除修復中被切開的DNA鏈減少。是核酸內外切酶存在缺陷。毛細血管擴張性共濟失調（AT）患者卻對電離輻射的敏感性比正常人大3～4倍。最近用SCGE證實AT細胞除了缺乏細胞周期控制，它修復雙鏈的能力也甚微［15］，并且很不精確，DNA分子游離端重接率很差，這就提示遺傳重組方面有短缺。范康尼貧血癥（FA）為一常染色體隱性遺傳病。Djuzenova等［16］報道不同的實驗室獨立測得的FA及FA攜帶者DNA初始損傷的尾力矩都明顯增高，且30～50 min殘余損傷和半修復時間較正常人明顯增高。 2小結 在放射生物學領域，SCGE已非常廣泛用于各種輻射損傷的檢測、放射敏感性的預測、輻射致癌致畸致突機制的探討、輻射修飾劑的評價等多個方面，均顯示了快速、簡便、靈敏等顯著的優(yōu)越性。隨著計算機圖像分析系統(tǒng)的完善及某些標準的統(tǒng)一，SCGE技術將成為放射生物學研究必不可少的檢測工具之一。 參考文獻 1Osting O, Johanson KJ. Microeletronphoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian. Biochem Biophys Res Commun,1984,123:291 2Singh NP, McCOY MT, Tice RR, et al. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Exp Cell Res， 1988,175:184 3鄭履康,宋博. 單細胞凝膠電泳技術的應用與發(fā)展. 中國職業(yè)醫(yī)學,2002,7（6）:45 4Olive PL. DNA damage and repair in individual cells:application of the comey assay in radiobiology. Inj J Radiat Biol， 1999， 75(4):395 5洪承皎,王靜. 應用單細胞凝膠電泳測輻射致外周血淋巴細胞DNA損傷. 中國工業(yè)醫(yī)學雜志,1999,12（6）:346 6Olive PL. Detection of hypoxia by measurement of DNA damage in individual cells from spheroids and murine tumours exposed to bioreductive drugs: I Tirapazamine. Br J Cancer, 1995,71:529 7Marty MS, Singh NP, Holsapple MP, et al. Influence of P53 iygosity on select sperm parameters of the mouse. Mut Res,1999,427(1):39 8Arends MJ, Morris RG, Wyllie AH, et al. Apoptosis:the role of the endonuclease. 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Environmental and Molecular Mutagenesis, 2002, 39(Suppl): 50 15Oppitz U, Denzinger S, Nachtrab U, et al. Radiation-induced comet-formation in human skin fibroblasts from radiotherapy patients with different normal tissue reactions. Strahlenth & Oncol, 1999,175(7): 341 16Djuzenova CS, Rothfuss A, Oppitz U, et al. Respons to X-irradiation of Fanconi anemia (FA) homozygous and heterozygous Qlls assessed by the single cell gel electrophoresis. Laboratory Investigation,2001, 81(2):105 (收稿日期：2003-05-28) |
2樓2011-03-27 23:23:45
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