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香奈兒同學(xué)銀蟲 (小有名氣)
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【求助/交流】請問哪位大俠知道Neutral Comet Assay是什么試驗(yàn)？ 已有3人參與
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香奈兒同學(xué)
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4樓2011-03-28 12:16:01
西瓜
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“彗星”分析法在放射生物學(xué)中的應(yīng)用 來源：廣東醫(yī)學(xué)雜志 點(diǎn)擊數(shù)：196 更新時(shí)間：2007-4-25 文章錄入：Admin “彗星”分析法在放射生物學(xué)中的應(yīng)用 賀玉香 綜述 夏云飛 審校 中山大學(xué)腫瘤防治中心放療科(廣州 510060) “彗星”分析法（comet assay）又叫單細(xì)胞凝膠電泳（single cell gel eletrophoresis, SCGE）或微凝膠電泳，是一種比較理想的單細(xì)胞水平檢測哺乳類有核細(xì)胞DNA損傷的新技術(shù)。由Ostling等［1］1984年首次提出，后經(jīng)Singh等［2］逐漸改進(jìn)�，F(xiàn)主要分為中性SCGE和堿性SCGE。其原理如下：去污劑或高鹽裂解溶液破壞細(xì)胞膜，使得95%以上的蛋白質(zhì)及細(xì)胞內(nèi)其他成分滲出膜進(jìn)入溶解液，DNA由于相對分子質(zhì)量大而留在原位。電泳時(shí)小的DNA斷片在電場作用下移出細(xì)胞核。經(jīng)溴乙啶染色后在紫外線(uv)照射下發(fā)出熒光，每個(gè)受損的細(xì)胞均呈現(xiàn) “彗星”外觀，明亮的頭部為細(xì)胞核，一系列的DNA斷片組成“彗尾”。未受損的細(xì)胞只有“彗核”而無“彗尾”。DNA斷片遷移的距離與DNA斷片分子質(zhì)量和電荷數(shù)相關(guān)，DNA斷片越多、越小，“彗尾”越長，又因熒光染料與DNA的結(jié)合是特異性的，因此，通過測定 “彗星”尾部長度和熒光強(qiáng)度可推測DNA鏈斷裂情況。如為中性裂解液加上50 ℃的處理只能破壞DNA超螺旋結(jié)構(gòu)，而DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)保存完好，只有小的雙鏈片段在電場作用下移出細(xì)胞核，形成 “彗星”尾部，故主要用于DNA雙鏈斷裂的檢測。而堿性SCGE中用堿性裂解液（pH>123）處理細(xì)胞，不但使細(xì)胞內(nèi)蛋白成分更徹底地分離，也有利于DNA雙螺旋破壞和單鏈片段移行，故用于檢測DNA單鏈斷裂。 此法的突出優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高。它可以測出每1657×10－17 kg中01個(gè)DNA的斷裂，甚至檢出自然光照體外淋巴細(xì)胞1 h引起的DNA損傷［3］。故可研究低劑量下的生物效應(yīng)。其次，它能對單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行分析，故適用于體內(nèi)、體外、不同實(shí)驗(yàn)室、不同細(xì)胞的研究。此外，此法還具有所需細(xì)胞樣本數(shù)少（<10 000 個(gè)）、無需同位素標(biāo)記、快速、簡便、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)。但是，此方法也存在一定的局限性。最為突出的是用于測量DNA損傷的幾個(gè)重要參數(shù)不可能標(biāo)準(zhǔn)化［4］。目前測量的指標(biāo)較多，主要有尾長、尾力矩、尾部DNA百分?jǐn)?shù)、尾慣量等，但每一指標(biāo)的應(yīng)用均有它的局限性。尾力矩為現(xiàn)常用的較靈敏指標(biāo)。另一個(gè)問題是 “彗星”圖像有可能被飽和。此外，SCGE實(shí)驗(yàn)結(jié)果還受電泳的電壓及時(shí)間、堿化處理?xiàng)l件及細(xì)胞數(shù)等多個(gè)因素的影響。因此，在嚴(yán)格控制影響因素后，才能使SCGE在檢測中發(fā)揮優(yōu)勢。近年該實(shí)驗(yàn)已廣泛用于放射生物學(xué)、遺傳毒理、生物監(jiān)測及腫瘤發(fā)病機(jī)制等多個(gè)領(lǐng)域。筆者著重介紹該技術(shù)在放射生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。 1應(yīng)用 11檢測各種輻射所致的DNA損傷單鏈斷裂是DNA輻射損傷的最敏感指標(biāo)，雙鏈斷裂是引起生物學(xué)效應(yīng)的主要原因。不同品質(zhì)的射線所致的損傷類型不同，如高LET射線引起雙鏈斷裂為主，低LET射線以致單鏈斷裂為主，而uv以引起堿基損傷為主。隨著射線LET的升高，單鏈斷裂減少，雙鏈斷裂增多。故可以通過檢測DNA損傷的不同類型來評(píng)價(jià)射線的生物學(xué)效應(yīng)。 111DNA單、雙鏈斷裂堿性SCGE是檢測DNA單鏈斷裂最靈敏的指標(biāo)［5］，通常用SCGE測到的DNA斷裂與劑量呈線性關(guān)系。取射線處理后的標(biāo)本在 ４*!℃ 條件下操作，直到熒光顯微鏡觀察。其目的是在低溫條件下抑制DNA修復(fù)的酶活性，使斷裂的DNA能得以保留至最后分析。根據(jù)“彗星”圖像出現(xiàn)的情況就能準(zhǔn)確測到某種射線是否造成DNA斷裂及斷裂情況。在中性環(huán)境下裂解、電泳后所測到的“彗星”圖像則可代表DNA雙鏈斷裂情況，因?yàn)殡p鏈斷裂比單鏈斷裂出現(xiàn)的機(jī)率少25～40倍，故所用射線的劑量應(yīng)大，并且要用嚴(yán)格的裂解液，檢出雙鏈斷裂的最少劑量是5 Gy。Olive等［6］證實(shí)了5～300 Gy的范圍內(nèi)“彗星”法檢測到的雙鏈斷裂也與劑量呈線性反應(yīng)關(guān)系。 112檢測DNA-DNA鏈間交聯(lián)、鏈內(nèi)交聯(lián)及DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)（DPC）輻射損傷致DNA鏈間交聯(lián)不如化學(xué)損傷多，但也能發(fā)生。其檢測方法有兩種：一是延長電泳時(shí)間，使對照組出現(xiàn)“彗星”影像，而處理組DNA遷移距離反而短于對照組。此法可檢出多種交聯(lián)形式。其二，處理組與對照組都加一標(biāo)準(zhǔn)的斷裂劑，這樣交聯(lián)的存在就會(huì)減少后者所致的DNA斷片釋放，與對照組相比“彗星”尾部減少的長度等指標(biāo)與交聯(lián)的量成正比。但是如所用射線引起的DNA交聯(lián)少而斷裂多，則用此法不太實(shí)際。因?yàn)樯渚�所致的DNA 鏈斷裂會(huì)產(chǎn)生一個(gè)很高的“彗星”背景而不利于判斷［4］。 有實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)小牛胸腺脫氧核糖核蛋白（DNP）在uv或γ射線照射以后，其中DNA中不能被提取的部分隨著照射劑量的增加而增加，但用胰蛋白酶處理，則觀察不到這部分DNA。因?yàn)閡v和γ射線照射導(dǎo)致了DNA和核蛋白交聯(lián)，影響了DNP中DNA的提出，胰蛋白酶能裂解DNA與蛋白質(zhì)之間的共價(jià)健，消化DNP中的蛋白質(zhì)部分，所以全部的DNA都能被提出。故SCGE測定DPC是根據(jù)加入蛋白酶前后DNA遷移距離的變化來計(jì)算交聯(lián)率，從而對射線引起DPC的能力進(jìn)行評(píng)價(jià)。Marty等［7］用SCGE研究p53基因?qū)?xì)胞增殖作用時(shí)發(fā)現(xiàn)p53缺陷型小鼠精子細(xì)胞DNA斷裂數(shù)目遠(yuǎn)低于野生型，推測可能由于p53基因缺陷引起DNA交聯(lián)。 uv能形成較多的DNA鏈內(nèi)交聯(lián)（嘧啶二聚體形成）。細(xì)胞內(nèi)源性酶對損傷DNA灶進(jìn)行切除及再連接修復(fù)，與此過程相吻合的是在SCGE中可相應(yīng)的觀察到“彗尾”的出現(xiàn)與消失。當(dāng)然DNA鏈被切開后再連接的速度非�？�，故在加入核酸內(nèi)切酶的同時(shí)加入抑制劑或使DNTPs漏出胞核，以阻斷切除修復(fù)中DNA合成與再連接，這才可檢測到DNA的細(xì)微損傷。例如用t4-uv特異性核酸內(nèi)切酶可監(jiān)測嘧啶二體的切除。 1．2細(xì)胞死亡的檢測放射治療中，如果輻射引起的DNA雙鏈斷裂等得不到修復(fù)，則細(xì)胞最終走向凋亡或壞死。凋亡細(xì)胞的特征性改變?yōu)楹怂醿?nèi)切酶在核小體間將DNA分裂成核小體大�。�180～200 bp）或其倍數(shù)的碎片。在SCGE電泳過程中DNA遷移距離數(shù)倍于正常細(xì)胞［8］。因大量的DNA斷片遷移形成脫離“彗頭”的巨大“彗尾”，二者很容易區(qū)分。因不需要再經(jīng)歷變性，中性SCGE和堿性SCGE均適用�？捎糜诳焖贆z測凋亡細(xì)胞的比例及DNA斷片的大小，因此在樣本量少時(shí)SCGE是代替流式細(xì)胞儀檢測凋亡的好方法。壞死細(xì)胞DNA斷片大小雖不規(guī)則，但在電場的作用下亦可形成巨大“彗尾”，容易與正常細(xì)胞鑒別，但很難與凋亡細(xì)胞區(qū)分。 1．3預(yù)測放射敏感性以往常用于預(yù)測腫瘤放射敏感性的技術(shù)主要是存活曲線，但早期的存活曲線在初始部分（劑量小于3 Gy）時(shí)不夠敏感，而這部分在放療上卻是最重要的，“彗星”法可檢出低至01 Gy的輻射損傷，因此可以彌補(bǔ)這點(diǎn)不足，還可以在低劑量階段解決腫瘤的輻射異質(zhì)性問題。故可以通過在放療前先取活組織標(biāo)本在體外放療2 Gy，用SCGE法測出DNA損傷程度，再在 37*!℃ 孵育測得其修復(fù)損傷的能力而該腫瘤對射線的敏感性。為臨床選擇治療方法提供依據(jù)。 1．31乏氧分?jǐn)?shù)的測定因?yàn)檠蹙哂泻軓?qiáng)的電子親和力，故在放射治療中起著親電子性增敏劑的作用。射線在氧合好的細(xì)胞中產(chǎn)生的DNA損傷3～4倍于乏氧細(xì)胞。故可以用“彗星”法測出放療以后乏氧尾矩與有氧尾矩之比，得出乏氧分?jǐn)?shù)。Olive等［９］發(fā)現(xiàn)以腫瘤治愈為終點(diǎn)指標(biāo)與用“彗星”法測得的乏氧分?jǐn)?shù)有良好的相關(guān)性。他們同時(shí)用此法檢測了73例姑息放療的轉(zhuǎn)移性腫瘤，其乏氧分?jǐn)?shù)波動(dòng)在000至067，平均015。并比較了現(xiàn)有的幾種測乏氧細(xì)胞的方法，提示“彗星”法是測中央氧壓<10 mmHg的腫瘤乏氧分?jǐn)?shù)最敏感的方法［10］。 但它的缺陷是要求在照后快速取材，否則單鏈修復(fù)會(huì)影響結(jié)果。且不能在治療前測得乏氧分?jǐn)?shù)。 1．32細(xì)胞的內(nèi)在敏感性影響內(nèi)在敏感性的主要因素是細(xì)胞修復(fù)DNA 損傷的能力不同。SCGE檢測DNA修復(fù)能力的原理在于：細(xì)胞經(jīng)受試物作用以后進(jìn)行孵育（DNA進(jìn)行修復(fù)），比較孵育前后DNA 遷移的變化可得出DNA的修復(fù)能力。這方面已有大量的文獻(xiàn)報(bào)道。呂長興等［11］用堿性SCGE測出鼻咽癌高分化鱗癌細(xì)胞系比肺腺癌細(xì)胞系半修復(fù)時(shí)間長，這與CNE-1對放療更敏感（D0值�。┯休^好的對應(yīng)關(guān)系；Olive等［12］測得人淋巴細(xì)胞TK6與鼠的L178Y-R細(xì)胞比CHO，V79修復(fù)明顯減慢而出現(xiàn)較多的殘余損傷，從而認(rèn)為TK6與L178Y-R細(xì)胞系存在修復(fù)缺陷。故SCGE法可發(fā)現(xiàn)修復(fù)缺陷細(xì)胞系，預(yù)測不同腫瘤的修復(fù)能力。大量實(shí)驗(yàn)提示乳腺癌患者“彗星”法測得的成纖維細(xì)胞和淋巴細(xì)胞DNA損傷與修復(fù)能力和臨床皮膚放射反應(yīng)存在良好的相關(guān)性［13,14］。與以往的檢測DNA修復(fù)實(shí)驗(yàn)如：核酸探針法、病毒探針法比較，具有簡單、快速、靈敏和不需同位素標(biāo)記等優(yōu)點(diǎn)。 1．33細(xì)胞周期在“彗星”檢測中，由于熒光染料與DNA 的結(jié)合是特異的，根據(jù)熒光強(qiáng)度可以對DNA進(jìn)行定量，從而鑒別不同周期、不同倍體的細(xì)胞。以往的一系列檢測均未能測得處于不同細(xì)胞周期的細(xì)胞對同一處理存在DNA鏈斷裂發(fā)生和重接率的差異。Olive等［12］用堿“彗星”分析DNA 損傷和細(xì)胞周期位置發(fā)現(xiàn)，測量單鏈斷裂的“彗尾”和半修復(fù)時(shí)間因細(xì)胞所處的細(xì)胞周期不同而不同。G1期的細(xì)胞半修復(fù)時(shí)間(37 s)較其他期細(xì)胞(51 s)短，故認(rèn)為“彗星”法能檢測出處于不同周期的細(xì)胞對射線修復(fù)能力的細(xì)小變化。S期的細(xì)胞用“彗星”法檢測鏈斷裂的敏感性均較其他期低，這是因?yàn)閺?fù)制產(chǎn)生的問題。S期DNA復(fù)制時(shí)形成的復(fù)制叉在堿性裂解液或電泳液時(shí)形成單鏈斷裂，所以增加了S期細(xì)胞的損傷背景。 134低劑量放射超敏感性的預(yù)測低劑量超敏感性即有些細(xì)胞在受到<50 cGy照射存在敏感性增高的現(xiàn)象，這使得靶區(qū)外正常組織的生物效應(yīng)將高于以前的預(yù)測值。因傳統(tǒng)的克隆記數(shù)法不能評(píng)價(jià)<100 cGy的肩區(qū)的存活變化，而SCGE具有高度敏感性，故可用于探測此現(xiàn)象。以便常規(guī)照射或三維適形放射治療時(shí)，盡量考慮野外正常組織的低劑量超敏問題以避免出現(xiàn)較嚴(yán)重的損傷。 由于“彗星”法能檢測出上述影響放射敏感性的因素，從而鑒別對射線敏感或抗拒的亞細(xì)胞群在放射生物學(xué)領(lǐng)域有重要的應(yīng)用價(jià)值。近年來隨著ATM，KU，XRCC等DNA修復(fù)相關(guān)基因功能的闡明，通過此途徑修飾細(xì)胞的輻射敏感性成為可能，而SCGE成為不可缺少的檢測工具。 14探討輻射致突變、致癌、致死效應(yīng)的機(jī)制由于SCGE可靈敏的檢測出各種DNA損傷與修復(fù)，故可用于探討輻射致突變、致癌、致死效應(yīng)具體是因?yàn)镈NA雙鏈斷裂、斷鏈重接失真，還是因?yàn)閴A基損傷或鏈間交聯(lián)等引起。用SCGE檢測著色性干皮�。╔P）患者經(jīng)uv照射后的淋巴細(xì)胞時(shí)，發(fā)現(xiàn)其“彗星”細(xì)胞百分率較正常人淋巴細(xì)胞經(jīng)uv照射后明顯減少，提示切除修復(fù)中被切開的DNA鏈減少。是核酸內(nèi)外切酶存在缺陷。毛細(xì)血管擴(kuò)張性共濟(jì)失調(diào)（AT）患者卻對電離輻射的敏感性比正常人大3～4倍。最近用SCGE證實(shí)AT細(xì)胞除了缺乏細(xì)胞周期控制，它修復(fù)雙鏈的能力也甚微［15］，并且很不精確，DNA分子游離端重接率很差，這就提示遺傳重組方面有短缺。范康尼貧血癥（FA）為一常染色體隱性遺傳病。Djuzenova等［16］報(bào)道不同的實(shí)驗(yàn)室獨(dú)立測得的FA及FA攜帶者DNA初始損傷的尾力矩都明顯增高，且30～50 min殘余損傷和半修復(fù)時(shí)間較正常人明顯增高。 2小結(jié) 在放射生物學(xué)領(lǐng)域，SCGE已非常廣泛用于各種輻射損傷的檢測、放射敏感性的預(yù)測、輻射致癌致畸致突機(jī)制的探討、輻射修飾劑的評(píng)價(jià)等多個(gè)方面，均顯示了快速、簡便、靈敏等顯著的優(yōu)越性。隨著計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)的完善及某些標(biāo)準(zhǔn)的統(tǒng)一，SCGE技術(shù)將成為放射生物學(xué)研究必不可少的檢測工具之一。 參考文獻(xiàn) 1Osting O, Johanson KJ. Microeletronphoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian. Biochem Biophys Res Commun,1984,123:291 2Singh NP, McCOY MT, Tice RR, et al. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Exp Cell Res， 1988,175:184 3鄭履康,宋博. 單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)的應(yīng)用與發(fā)展. 中國職業(yè)醫(yī)學(xué),2002,7（6）:45 4Olive PL. DNA damage and repair in individual cells:application of the comey assay in radiobiology. Inj J Radiat Biol， 1999， 75(4):395 5洪承皎,王靜. 應(yīng)用單細(xì)胞凝膠電泳測輻射致外周血淋巴細(xì)胞DNA損傷. 中國工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志,1999,12（6）:346 6Olive PL. Detection of hypoxia by measurement of DNA damage in individual cells from spheroids and murine tumours exposed to bioreductive drugs: I Tirapazamine. Br J Cancer, 1995,71:529 7Marty MS, Singh NP, Holsapple MP, et al. Influence of P53 iygosity on select sperm parameters of the mouse. Mut Res,1999,427(1):39 8Arends MJ, Morris RG, Wyllie AH, et al. Apoptosis:the role of the endonuclease. 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Environmental and Molecular Mutagenesis, 2002, 39(Suppl): 50 15Oppitz U, Denzinger S, Nachtrab U, et al. Radiation-induced comet-formation in human skin fibroblasts from radiotherapy patients with different normal tissue reactions. Strahlenth & Oncol, 1999,175(7): 341 16Djuzenova CS, Rothfuss A, Oppitz U, et al. Respons to X-irradiation of Fanconi anemia (FA) homozygous and heterozygous Qlls assessed by the single cell gel electrophoresis. Laboratory Investigation,2001, 81(2):105 (收稿日期：2003-05-28) |
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caizeyuan922
鐵桿木蟲 (著名寫手)
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5樓2013-11-21 15:39:22
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