超濾管使用方法和注意事項(xiàng)

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1樓 2011-03-29 19:43:56

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超濾管使用方法和注意事項(xiàng)

spsgirl(金幣+4): 2011-04-02 14:00:24

蛋白濃縮和換Buffer通常使用的超濾管，常用Millipore的Amicon-Ultra-15超濾管（MWCO10kD）。也有其它型號的、不同體積大小和MWCO超濾管可選，視目的蛋白的分子量與濃縮前體積、濃縮目標(biāo)體積而定�？芍貜�(fù)使用，使用一次就扔掉太浪費(fèi)。以下是個(gè)人總結(jié)的使用方法和注意事項(xiàng)。
  1、選擇合適的超濾管，主要考慮MWCO和濃縮體積，最常見的是Ultra-15（10kD）。到底選擇多大截留分子量比較合適呢？10kDa、 5kDa、還是30kDa？通常應(yīng)截留分子量不應(yīng)大于目的蛋白分子量的1/3，比如目的蛋白分子量為35kDa，就可以選擇10kDa截留分子量的超濾管。若目的蛋白分子量為10kD左右，則可以用截留分子量3kD的超濾管。認(rèn)真閱讀使用說明書，注意超濾膜對各種化學(xué)物質(zhì)的耐受程度有所不同，表格中有。
  2、新買來的超濾是干燥的，使用前加入MilliQ水，水量完全過膜，冰浴或冰箱里預(yù)冷幾分鐘。然后將水倒出，即可加入蛋白液，加入的多少，以不超過管頂?shù)陌拙€為準(zhǔn)。操作要輕，加入蛋白液前，超濾管需要插在冰上預(yù)冷。
  3、平衡。質(zhì)量和重心二者都要達(dá)到平衡。注意轉(zhuǎn)速和加速度不可太快，否則直接損壞超濾膜。開始離心超濾（離心機(jī)預(yù)冷至4度）。不同離心機(jī)的轉(zhuǎn)速 rpm換算成g之后，有所不同。具體可參閱附件里的說明書。離心機(jī)的加速度調(diào)至最低檔，減小對膜的壓力。注意，一定要等離心機(jī)達(dá)到目的轉(zhuǎn)速之后，方可離開離心機(jī)，否則離心機(jī)出問題時(shí)，無法第一時(shí)間處理，后果不可預(yù)測！膜與轉(zhuǎn)軸的方向根據(jù)說明書調(diào)整（角轉(zhuǎn)離心機(jī)的情況是膜與軸垂直）。在實(shí)際使用中，一般轉(zhuǎn)速開的比說明書里的要低，這樣可以延長離心管的使用壽命。
  4、當(dāng)濃縮到剩下1ml時(shí)，【取50ul國產(chǎn)Bradford溶液，加入10ul流穿，看有沒變藍(lán)色，以此判斷超濾管是否漏掉蛋白。如果管漏了，將上層和流穿重新倒入新管中開始超濾。要精確判斷是否漏管，用5mgml的BSA離心10min，再取流穿，跑蛋白膠或Bradford粗測】，繼續(xù)加入剩下的蛋白液濃縮（在冰上操作，防止蛋白受熱），直到所有濃縮液都加完為止。離心過程中注意是否發(fā)生蛋白沉淀，導(dǎo)致堵管。若發(fā)生沉淀，要確定沉淀的具體原因，是蛋白濃度過高還是Buffer不合適；前者可用多根超濾管同時(shí)超濾，降低濃度的辦法解決，后者的方法是換不同的Buffer，直到蛋白不發(fā)生沉淀為止。
  5、前面幾步用以濃縮蛋白，如果要換Buffer，在總蛋白液濃縮至1ml左右的時(shí)候，輕輕加入新的Buffer（經(jīng)0.22um超濾膜超濾），再濃縮至1ml左右，連續(xù)三次，最后一次的濃縮終體積根據(jù)需要的蛋白濃度而定，一般不多于500ul，也有濃縮至200ul以內(nèi)的情況。按照每次至少10倍左右的體積濃縮算，三次達(dá)到1000倍以上，基本上可以達(dá)到換buffer的目的。
  6、取出最終蛋白濃縮液的操作在冰上操作，用黃槍頭（200ul）取，輕輕順著邊緣插入槍頭，輕輕吹打、混勻蛋白液，注意不要碰到超濾膜，然后吸取濃縮液，每次吸接近200ul，直到吸完。管底剩下的最后一點(diǎn)濃縮液不必吸取，否則難度太大，有可能損壞超濾膜。最后加入MilliQ水到超濾管中，沒過超濾膜，防止膜失水變干。
  7、以下是處理超濾管，重復(fù)利用超濾管的步驟。
  8、倒出超濾管里的水，用milliQ水輕輕潤洗幾次，【若管底有可見的蛋白沉淀，可以先加入水，然后用槍頭吹打，注意不要碰到膜，吹打至沉淀懸起，然后倒掉，不可用自來水猛沖】然后加入0.2M的NaOH溶液，室溫放置20min，期間平衡超濾管。再離心10min。倒出殘留的NaOH溶液，將管芯浸入MilliQ水的燒杯(1或2L)中,放置幾個(gè)小時(shí),再換新的水,放置幾個(gè)小時(shí)，不斷稀釋NaOH濃度。50ml管和蓋子用自來水洗，內(nèi)壁再用 MilliQ水洗干凈。
  9、取出浸沒的管芯，加至接近滿的MilliQ水，50ml管也加滿MilliQ水，將管芯慢慢放入50ml離心管，排出部分水，然后蓋上蓋子，放4度保存，直到下次使用。一般來說，按照上述步驟和注意事項(xiàng)，每根管用三四年不會壞。

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2樓2011-03-30 00:51:39

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3樓2011-03-30 00:52:29

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spsgirl(金幣+1): 2011-04-02 13:59:58

看你的要去除的物質(zhì)分子量大小，有3KDa-30KDa不等，還有就是0.5ml、5ml、15ml的大小的，看你自己的樣品量，去網(wǎng)上搜一下就知道了。

4樓2011-04-02 11:45:31

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Originally posted by gaogaoxing at 2011-03-30 00:51:39:
蛋白濃縮和換Buffer通常使用的超濾管，常用Millipore的Amicon-Ultra-15超濾管（MWCO10kD）。也有其它型號的、不同體積大小和MWCO超濾管可選，視目的蛋白的分子量與濃縮前體積、濃縮目標(biāo)體積而定。可重復(fù)使用，使 ...

是這樣的，我想除掉未反應(yīng)的多肽，能用超濾管嗎，那我怎么樣確定我已經(jīng)除去了未反應(yīng)的多肽。

5樓2011-04-02 14:02:07

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另外，你寫的50mL離心管，我現(xiàn)在還沒見過啊

6樓2011-04-02 14:03:25

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小木蟲(金幣+0.5):給個(gè)紅包，謝謝回帖交流

超濾和透析的作用差不多，區(qū)別是超濾更便捷，但透析更干凈。所以超濾也是能達(dá)到你的目的的。4mL的超濾管比較常用，50mL的當(dāng)然也有，體積越大，價(jià)格越貴。你打電話咨詢你們學(xué)校常合作的生物試劑耗材公司，一般都會有的。

7樓2011-04-03 10:45:14

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Originally posted by nelson9865 at 2011-04-03 10:45:14:
超濾和透析的作用差不多，區(qū)別是超濾更便捷，但透析更干凈。所以超濾也是能達(dá)到你的目的的。4mL的超濾管比較常用，50mL的當(dāng)然也有，體積越大，價(jià)格越貴。你打電話咨詢你們學(xué)校常合作的生物試劑耗材公司，一般都會 ...

其實(shí)我就是要分離我已經(jīng)標(biāo)記好的東東，和為標(biāo)記上的東東。要去掉多肽，應(yīng)該用多大的超濾管，或者用什么樣的透析膜

8樓2011-04-06 12:56:41

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Originally posted by spsgirl at 2011-04-06 12:56:41:
其實(shí)我就是要分離我已經(jīng)標(biāo)記好的東東，和為標(biāo)記上的東東。要去掉多肽，應(yīng)該用多大的超濾管，或者用什么樣的透析膜

那要看你已經(jīng)標(biāo)記好的東東和未標(biāo)記上的東東的分子量差別，選擇一個(gè)截留分子量在這兩個(gè)中間的。體積就根據(jù)需要選擇。還有更多關(guān)于超濾管的帖子在小木蟲上，你可以搜索一下。

9樓2011-04-06 23:44:12

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nelson9865

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PS：超濾管一般要選擇截留分子為要截留的分子量的三分之一到三分之二才會有較好的效果

10樓2011-04-06 23:55:15

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向西的風(fēng)

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送鮮花一朵

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2樓: Originally posted by gaogaoxing at 2011-03-30 00:51:39:
蛋白濃縮和換Buffer通常使用的超濾管，常用Millipore的Amicon-Ultra-15超濾管（MWCO10kD）。也有其它型號的、不同體積大小和MWCO超濾管可選，視目的蛋白的分子量與濃縮前體積、濃縮目標(biāo)體積而定�？芍貜�(fù)使用，使 ...

很好很強(qiáng)大，學(xué)習(xí)了，謝謝~

11樓2011-11-09 15:38:55

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0602120131

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嗯，超濾管的確是個(gè)好東西，用起來很方便

12樓2012-06-06 17:52:30

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hao-

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2樓: Originally posted by gaogaoxing at 2011-03-30 00:51:39
蛋白濃縮和換Buffer通常使用的超濾管，常用Millipore的Amicon-Ultra-15超濾管（MWCO10kD）。也有其它型號的、不同體積大小和MWCO超濾管可選，視目的蛋白的分子量與濃縮前體積、濃縮目標(biāo)體積而定。可重復(fù)使用，使用 ...

謝謝，非常受教

13樓2014-07-10 22:53:23

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請問超濾管能用來分離固體緩釋顆粒中未被包覆的藥物分子嗎？