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spsgirl銀蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
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[交流]
【求助】超濾管的使用
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3樓2011-03-30 00:52:29
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超濾管使用方法和注意事項(xiàng)
spsgirl(金幣+4): 2011-04-02 14:00:24
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蛋白濃縮和換Buffer通常使用的超濾管，常用Millipore的Amicon-Ultra-15超濾管（MWCO10kD）。也有其它型號(hào) 的、不同體積大小和MWCO超濾管可選，視目的蛋白的分子量與濃縮前體積、濃縮目標(biāo)體積而定�？芍貜�(fù)使用，使用一次就扔掉太浪費(fèi)。以下是個(gè)人總結(jié)的使用方 法和注意事項(xiàng)。 1、選擇合適的超濾管，主要考慮MWCO和濃縮體積，最常見(jiàn)的是Ultra-15（10kD）。到底選擇多大截留分子量比較合適呢？10kDa、 5kDa、還是30kDa？通常應(yīng)截留分子量不應(yīng)大于目的蛋白分子量的1/3，比如目的蛋白分子量為35kDa，就可以選擇10kDa截留分子量的超濾管。若目的蛋白分子量為10kD左右，則可以用截留分子量3kD的超濾管。認(rèn)真閱讀使用說(shuō)明書(shū)，注意超濾膜對(duì)各種化學(xué)物質(zhì)的耐受程度有所不同，表格中有。 2、新買(mǎi)來(lái)的超濾是干燥的，使用前加入MilliQ水，水量完全過(guò)膜，冰浴或冰箱里預(yù)冷幾分鐘。然后將水倒出，即可加入蛋白液，加入的多少，以不超過(guò)管頂?shù)陌拙�為準(zhǔn)。操作要輕，加入蛋白液前，超濾管需要插在冰上預(yù)冷。 3、平衡。質(zhì)量和重心二者都要達(dá)到平衡。注意轉(zhuǎn)速和加速度不可太快，否則直接損壞超濾膜。開(kāi)始離心超濾（離心機(jī)預(yù)冷至4度）。不同離心機(jī)的轉(zhuǎn)速 rpm換算成g之后，有所不同。具體可參閱附件里的說(shuō)明書(shū)。離心機(jī)的加速度調(diào)至最低檔，減小對(duì)膜的壓力。注意，一定要等離心機(jī)達(dá)到目的轉(zhuǎn)速之后，方可離開(kāi) 離心機(jī)，否則離心機(jī)出問(wèn)題時(shí)，無(wú)法第一時(shí)間處理，后果不可預(yù)測(cè)！膜與轉(zhuǎn)軸的方向根據(jù)說(shuō)明書(shū)調(diào)整（角轉(zhuǎn)離心機(jī)的情況是膜與軸垂直）。在實(shí)際使用中，一般轉(zhuǎn)速 開(kāi)的比說(shuō)明書(shū)里的要低，這樣可以延長(zhǎng)離心管的使用壽命。 4、當(dāng)濃縮到剩下1ml時(shí)，【取50ul國(guó)產(chǎn)Bradford溶液，加入10ul流穿，看有沒(méi)變藍(lán)色，以此判斷超濾管是否漏掉蛋白。如果管漏了，將上層和流穿重新倒入新管中開(kāi)始超濾。要精確判斷是否漏管，用5mgml的BSA離心10min，再取流穿，跑蛋白膠或Bradford粗測(cè)】，繼續(xù)加入剩下的蛋白液濃縮（在冰上操作，防止蛋白受熱），直到所有濃縮液都加完為止。離心過(guò)程中注意是否發(fā)生蛋白沉淀，導(dǎo)致堵管。若發(fā)生沉淀，要確定沉淀的具體原因，是蛋白濃度過(guò)高還是Buffer不合適；前者可用多根超濾管同時(shí)超濾，降低濃度的辦法解決，后者的方法是換不同的Buffer，直到蛋白不發(fā)生沉淀為 止。 5、前面幾步用以濃縮蛋白，如果要換Buffer，在總蛋白液濃縮至1ml左右的時(shí)候，輕輕加入新的Buffer（經(jīng)0.22um超濾膜超濾），再 濃縮至1ml左右，連續(xù)三次，最后一次的濃縮終體積根據(jù)需要的蛋白濃度而定，一般不多于500ul，也有濃縮至200ul以內(nèi)的情況。按照每次至少10倍 左右的體積濃縮算，三次達(dá)到1000倍以上，基本上可以達(dá)到換buffer的目的。 6、取出最終蛋白濃縮液的操作在冰上操作，用黃槍頭（200ul）取，輕輕順著邊緣插入槍頭，輕輕吹打、混勻蛋白液，注意不要碰到超濾膜，然后吸取 濃縮液，每次吸接近200ul，直到吸完。管底剩下的最后一點(diǎn)濃縮液不必吸取，否則難度太大，有可能損壞超濾膜。最后加入MilliQ水到超濾管中，沒(méi)過(guò) 超濾膜，防止膜失水變干。 7、以下是處理超濾管，重復(fù)利用超濾管的步驟。 8、倒出超濾管里的水，用milliQ水輕輕潤(rùn)洗幾次，【若管底有可見(jiàn)的蛋白沉淀，可以先加入水，然后用槍頭吹打，注意不要碰到膜，吹打至沉淀懸起，然后倒掉，不可用自來(lái)水猛沖】然后加入0.2M的NaOH溶液，室溫放置20min，期間平衡超濾管。再離心10min。倒出殘留的NaOH溶液，將 管芯浸入MilliQ水的燒杯(1或2L)中,放置幾個(gè)小時(shí),再換新的水,放置幾個(gè)小時(shí)，不斷稀釋NaOH濃度。50ml管和蓋子用自來(lái)水洗，內(nèi)壁再用 MilliQ水洗干凈。 9、取出浸沒(méi)的管芯，加至接近滿的MilliQ水，50ml管也加滿MilliQ水，將管芯慢慢放入50ml離心管，排出部分水，然后蓋上蓋子，放4度保存，直到下次使用。一般來(lái)說(shuō)，按照上述步驟和注意事項(xiàng)，每根管用三四年不會(huì)壞。 |
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向西的風(fēng)2樓2011-03-30 00:51:39
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