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lhm_hnyj金蟲 (小有名氣)
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[交流]
【求助/交流】100bp左右SYBR Green I實時熒光？可能嗎？ 已有2人參與
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最近有家單位報送材料讓進行實驗復(fù)核，其中有用到SYBR Green I實時熒光對100bp左右目的片段定性檢測，拋開引物特異性不說，引物二聚體都很有可能對目的片段造成干擾吧。初試了一下，結(jié)果稀里嘩啦，陰性Tm75°，陽性77°；Ct值陰性31，陽性出現(xiàn)三個值，13.7,15.9,22.很是崩潰。這影響因素可太多了，一條一條排除可是有得折騰了，關(guān)鍵是不知道中不值得這么費勁，這么小片段用這樣的方法來定性可行嗎？麻煩大家給支支招 |
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西瓜
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dhd997(金幣+6): good 2011-04-01 19:52:38
小木蟲(金幣+0.5):給個紅包，謝謝回帖交流
dhd997(金幣+6): good 2011-04-01 19:52:38
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對樓主稀里嘩啦的結(jié)果沒看明白--！ But, 100 bp的片段用來做熒光定量PCR是比較合適的大小哦。片段太長，PCR體系消耗很快，酶活力、引物、dNTP這些東東只要有一個不足，PCR反應(yīng)就不滿足2的N次方的公式了，這樣定量就不準確了。 短的片段，容易實現(xiàn)有效擴增，定量更準確，實驗的一致性也更好，而且片段短了，延伸時間也短，可以縮短整個PCR的時間。 天根的培訓(xùn)資料提到，熒光定量PCR的擴增片段最好在100-150 bp，最長不超過400 bp。TaKaRa的試劑盒說明書里說，擴增片段最好在80-150 bp，最長不超過300 bp。我見過的，一般用 150=200 bp。 熒光定量PCR對引物的設(shè)計要求是比較高的，引物二聚體的問題，一般在設(shè)計引物時就考慮到了，會盡量避免選用容易形成二聚體的引物。 如果樓主是剛開始做，我覺得加樣造成誤差的可能性比較大哦。你可以試試同樣的東西做3管，看看自己操作的一致性如何。 |
2樓2011-04-01 10:43:43
lhm_hnyj
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3樓2011-04-01 13:44:30
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