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JessieDai銅蟲 (小有名氣)
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[交流]
【求助】有人在做焦磷酸測序么？希望得到大蝦的幫助 已有10人參與
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實驗室想做高通量測序，貌似一般就是那個焦磷酸測序吧，由于沒找到太多的關(guān)于這方面的知識，基本處于什么都不清楚的狀態(tài)，希望做這個的大蝦能夠介紹一下或者給點相關(guān)的資料，O(∩_∩)O謝謝 |
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 二代測序 | 高通量測序 |
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看天(金幣+2, EPI+1): 熱情大方 授予一個EPI 希望常來 2011-04-06 18:18:12
看天(金幣+2, EPI+1): 熱情大方 授予一個EPI 希望常來 2011-04-06 18:18:12
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有什么想問的？可以問我，在這個版上很少看到2代測序的應(yīng)用以及bioinformatic交流的帖子，但希望你能現(xiàn)簡單熟悉一下2代測序儀，畢竟已經(jīng)問世很多年了，這些資料在相應(yīng)公司網(wǎng)站上很容易查到。如果在應(yīng)用過程中有什么困難或者對于實驗設(shè)計方面有哪些要注意的可以問我，我從08年開始就應(yīng)用第二代測序儀做轉(zhuǎn)錄組的研究了，2010開始拓展到大型基因組方向，對于實驗和分析的實際操作的一些問題和困難還是很清楚地�；蛘吣憧梢钥匆幌戮C述性的文章。目前的研究在國內(nèi)太火了，都想做2代測序的應(yīng)用，但很多對于實驗設(shè)計和分析都是估計不足的。所以希望在這些方面能夠?qū)Υ蠹矣行⿴椭?br />
[ Last edited by genomelin on 2011-4-6 at 15:15 ] |
5樓2011-04-06 15:01:26
rb
木蟲 (著名寫手)
小笨蟲蟲
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小木蟲(金幣+0.5):給個紅包，謝謝回帖交流
看天(EPI+1): 鼓勵分享自己的實驗經(jīng)歷 2011-04-06 18:19:33
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06年自己做這方面工作時候的一個情況。后來很少接觸。（直接copy過來了不再編輯了，少了一些圖片） I 原理簡介： 測序引物與單鏈PCR擴增的DNA模板相結(jié)合。然后將其與DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和三磷酸腺苷雙磷酸酶，以及底物APS和熒光素一起孵育。 四種dNTP（dATP，dTTP，dCTP，dGTP）之一被加入反應(yīng)體系，如與模扳配對（A—T，C—G），此dNTP與引物的末端形成共價鍵，dNTP的焦磷酸基團（PPi）釋放出來。而且釋放出來的Ppi的量與和模板結(jié)合的dNTP的量成正比。 ATP硫酸化酶在腺苷酰硫酸存在的情況下催化PPi形成ATP，ATP驅(qū)動熒光素酶介導的螢光素向氧合螢光素的轉(zhuǎn)化，氧合螢光素發(fā)出與ATP量成正比的可見光信號。光信號由CCD攝像機檢測并由pyrogram™反應(yīng)為峰。每個光信號的峰高與反應(yīng)中摻入的核苷酸數(shù)目成正比。 ATP和未摻入的dNTP由三磷酸腺苷雙磷酸酶降解，淬滅光信號，并再生反應(yīng)體系。 然后加入下一種dNTP。最終待測序列順序，即可從反應(yīng)光強的信號峰中讀出。在此過程之中有幾點值得注意的是，在體系中使用的是dATP S而非dATP，因為dATP S不是熒光素酶的底物，而且DNA聚合酶對dATP S的催化效率更高。而且在系統(tǒng)之中，底物的濃度已經(jīng)最佳化，使得dNTP的降解速度慢于它的摻入速度，ATP的合成速度快于水解速度，其中三磷酸腺苷雙磷酸酶的特異濃度，可以保證降解完全，使系統(tǒng)復原。 II 操作步驟： 在使用前，保證所有溶液都達到室溫； 在PSQ 96板中預先加入45μl含有0.3μM測序引物的annealing buffer； 使用Vertex混勻Sepharose beads； 將需要使用的sepharoe beads總量（每樣本3μl）轉(zhuǎn)移到一個Eppendorf管中； 在sepharose bead中加入binding buffer，使得平均每個樣品約有50μl的體積，將混合物混勻； 將以上混合物加入PCR產(chǎn)物（50μl反應(yīng)體積）中，每樣本50μl； 將PCR產(chǎn)物在常溫下混勻10分鐘，使得beads與生物素結(jié)合，對于較長片段，可適當延長混勻時間； 在Vacuum prep workstation中，四個樣品板中依次加入180ml高純水、70％乙醇、washing buffer和120ml Denaturation buffer； 打開vacuum prep workstation的泵，將vacuum prep tool在高純水中清洗30秒； 然后將vacuum prep tool移到PCR板中，抓取sepharose beads（請在beads與PCR產(chǎn)物結(jié)合后三分鐘內(nèi)完成此操作）； 拿起PCR板，檢查是否大部分beads都被吸附在了vacuum prep tool上； 將vacuum prep tool放入70％乙醇中5秒； 然后移到denatureation buffer中5秒； 再移到washing buffer中清洗5－10秒； 關(guān)掉泵； 將vacuum prep tool放入含有測序引物的板中，搖動，釋放sepharose beads（測序引物也可最后加入） 使用高純水清洗vacuum prep tool； 將放有樣品的PSQ 96板放在ThermoPlate上加熱到80℃ 2分鐘，再冷卻到室溫，即可進行Pyrosequencing反應(yīng)。 |
6樓2011-04-06 15:39:36
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看天(金幣+2): 鼓勵回答 2011-04-06 12:58:03
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看天(金幣+2): 鼓勵回答 2011-04-06 12:58:03
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嗯...對于不熟悉高通量測序，但又想做一些這方面實驗的童鞋們，我的建議是先好好了解一下這項技術(shù)，想清楚實驗目的是什么，測序要獲得哪些主要信息。因為這個玩意兒少說也要幾萬塊（小RNA之類不算），要測的樣本多，幾十萬上百萬的花費也是有可能的。所以先自己想明白了，才好和測序公司談。 最后，更正一點，高通量測序可不止焦磷酸測序一種，具體的可以看看下面的資料~ http://g.zhubajie.com/urllink.php?id=109434909uls2xeuwys00rq4 |
4樓2011-04-06 09:29:53
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看天(金幣+4): 有理 2011-04-06 18:19:57
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看天(金幣+4): 有理 2011-04-06 18:19:57
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1 高通量不僅僅是焦磷酸測序； 2 羅氏的454是焦磷酸，但是通量比其他的二代低，每個RUN需要的銀子也多，好處是讀長很長（400bp+）； 3 Qiagen的焦磷酸測序還不是一般意義上的高通量二代測序，雖然測序原理是一樣的，但是通量更小，且一般是需要自己選擇目的基因并設(shè)計引物的； 4 LZ即便打算要做高通量了，也沒必要自己去設(shè)計protocol，需要做的是選擇適合自己的方案，然后會有現(xiàn)成的protocol，比你自己摸索的強…… |
7樓2011-04-06 18:12:34
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