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JessieDai銅蟲 (小有名氣)
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[交流]
【求助】有人在做焦磷酸測序么？希望得到大蝦的幫助 已有10人參與
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實(shí)驗(yàn)室想做高通量測序，貌似一般就是那個(gè)焦磷酸測序吧，由于沒找到太多的關(guān)于這方面的知識(shí)，基本處于什么都不清楚的狀態(tài)，希望做這個(gè)的大蝦能夠介紹一下或者給點(diǎn)相關(guān)的資料，O(∩_∩)O謝謝 |
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 二代測序 | 高通量測序 |
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看天(金幣+2, EPI+1): 熱情大方 授予一個(gè)EPI 希望常來 2011-04-06 18:18:12
看天(金幣+2, EPI+1): 熱情大方 授予一個(gè)EPI 希望常來 2011-04-06 18:18:12
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有什么想問的？可以問我，在這個(gè)版上很少看到2代測序的應(yīng)用以及bioinformatic交流的帖子，但希望你能現(xiàn)簡單熟悉一下2代測序儀，畢竟已經(jīng)問世很多年了，這些資料在相應(yīng)公司網(wǎng)站上很容易查到。如果在應(yīng)用過程中有什么困難或者對于實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方面有哪些要注意的可以問我，我從08年開始就應(yīng)用第二代測序儀做轉(zhuǎn)錄組的研究了，2010開始拓展到大型基因組方向，對于實(shí)驗(yàn)和分析的實(shí)際操作的一些問題和困難還是很清楚地�；蛘吣憧梢钥匆幌戮C述性的文章。目前的研究在國內(nèi)太火了，都想做2代測序的應(yīng)用，但很多對于實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和分析都是估計(jì)不足的。所以希望在這些方面能夠?qū)Υ蠹矣行⿴椭?br />
[ Last edited by genomelin on 2011-4-6 at 15:15 ] |
5樓2011-04-06 15:01:26
rb
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看天(EPI+1): 鼓勵(lì)分享自己的實(shí)驗(yàn)經(jīng)歷 2011-04-06 18:19:33
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看天(EPI+1): 鼓勵(lì)分享自己的實(shí)驗(yàn)經(jīng)歷 2011-04-06 18:19:33
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06年自己做這方面工作時(shí)候的一個(gè)情況。后來很少接觸。（直接copy過來了不再編輯了，少了一些圖片） I 原理簡介： 測序引物與單鏈PCR擴(kuò)增的DNA模板相結(jié)合。然后將其與DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和三磷酸腺苷雙磷酸酶，以及底物APS和熒光素一起孵育。 四種dNTP（dATP，dTTP，dCTP，dGTP）之一被加入反應(yīng)體系，如與模扳配對（A—T，C—G），此dNTP與引物的末端形成共價(jià)鍵，dNTP的焦磷酸基團(tuán)（PPi）釋放出來。而且釋放出來的Ppi的量與和模板結(jié)合的dNTP的量成正比。 ATP硫酸化酶在腺苷酰硫酸存在的情況下催化PPi形成ATP，ATP驅(qū)動(dòng)熒光素酶介導(dǎo)的螢光素向氧合螢光素的轉(zhuǎn)化，氧合螢光素發(fā)出與ATP量成正比的可見光信號(hào)。光信號(hào)由CCD攝像機(jī)檢測并由pyrogram™反應(yīng)為峰。每個(gè)光信號(hào)的峰高與反應(yīng)中摻入的核苷酸數(shù)目成正比。 ATP和未摻入的dNTP由三磷酸腺苷雙磷酸酶降解，淬滅光信號(hào)，并再生反應(yīng)體系。 然后加入下一種dNTP。最終待測序列順序，即可從反應(yīng)光強(qiáng)的信號(hào)峰中讀出。在此過程之中有幾點(diǎn)值得注意的是，在體系中使用的是dATP S而非dATP，因?yàn)閐ATP S不是熒光素酶的底物，而且DNA聚合酶對dATP S的催化效率更高。而且在系統(tǒng)之中，底物的濃度已經(jīng)最佳化，使得dNTP的降解速度慢于它的摻入速度，ATP的合成速度快于水解速度，其中三磷酸腺苷雙磷酸酶的特異濃度，可以保證降解完全，使系統(tǒng)復(fù)原。 II 操作步驟： 在使用前，保證所有溶液都達(dá)到室溫； 在PSQ 96板中預(yù)先加入45μl含有0.3μM測序引物的annealing buffer； 使用Vertex混勻Sepharose beads； 將需要使用的sepharoe beads總量（每樣本3μl）轉(zhuǎn)移到一個(gè)Eppendorf管中； 在sepharose bead中加入binding buffer，使得平均每個(gè)樣品約有50μl的體積，將混合物混勻； 將以上混合物加入PCR產(chǎn)物（50μl反應(yīng)體積）中，每樣本50μl； 將PCR產(chǎn)物在常溫下混勻10分鐘，使得beads與生物素結(jié)合，對于較長片段，可適當(dāng)延長混勻時(shí)間； 在Vacuum prep workstation中，四個(gè)樣品板中依次加入180ml高純水、70％乙醇、washing buffer和120ml Denaturation buffer； 打開vacuum prep workstation的泵，將vacuum prep tool在高純水中清洗30秒； 然后將vacuum prep tool移到PCR板中，抓取sepharose beads（請?jiān)赽eads與PCR產(chǎn)物結(jié)合后三分鐘內(nèi)完成此操作）； 拿起PCR板，檢查是否大部分beads都被吸附在了vacuum prep tool上； 將vacuum prep tool放入70％乙醇中5秒； 然后移到denatureation buffer中5秒； 再移到washing buffer中清洗5－10秒； 關(guān)掉泵； 將vacuum prep tool放入含有測序引物的板中，搖動(dòng)，釋放sepharose beads（測序引物也可最后加入） 使用高純水清洗vacuum prep tool； 將放有樣品的PSQ 96板放在ThermoPlate上加熱到80℃ 2分鐘，再冷卻到室溫，即可進(jìn)行Pyrosequencing反應(yīng)。 |
6樓2011-04-06 15:39:36
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2樓2011-04-05 23:34:35
JessieDai
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3樓2011-04-06 08:42:39
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看天(金幣+2): 鼓勵(lì)回答 2011-04-06 12:58:03
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看天(金幣+2): 鼓勵(lì)回答 2011-04-06 12:58:03
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嗯...對于不熟悉高通量測序，但又想做一些這方面實(shí)驗(yàn)的童鞋們，我的建議是先好好了解一下這項(xiàng)技術(shù)，想清楚實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖鞘裁�，測序要獲得哪些主要信息。因?yàn)檫@個(gè)玩意兒少說也要幾萬塊（小RNA之類不算），要測的樣本多，幾十萬上百萬的花費(fèi)也是有可能的。所以先自己想明白了，才好和測序公司談。 最后，更正一點(diǎn)，高通量測序可不止焦磷酸測序一種，具體的可以看看下面的資料~ http://g.zhubajie.com/urllink.php?id=109434909uls2xeuwys00rq4 |
4樓2011-04-06 09:29:53
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小木蟲(金幣+0.5):給個(gè)紅包，謝謝回帖交流
看天(金幣+4): 有理 2011-04-06 18:19:57
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1 高通量不僅僅是焦磷酸測序； 2 羅氏的454是焦磷酸，但是通量比其他的二代低，每個(gè)RUN需要的銀子也多，好處是讀長很長（400bp+）； 3 Qiagen的焦磷酸測序還不是一般意義上的高通量二代測序，雖然測序原理是一樣的，但是通量更小，且一般是需要自己選擇目的基因并設(shè)計(jì)引物的； 4 LZ即便打算要做高通量了，也沒必要自己去設(shè)計(jì)protocol，需要做的是選擇適合自己的方案，然后會(huì)有現(xiàn)成的protocol，比你自己摸索的強(qiáng)…… |
7樓2011-04-06 18:12:34
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10樓2013-03-31 11:00:42
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