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【求助】幾個(gè)關(guān)于實(shí)時(shí)定量PCR的問題
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在PCR條件優(yōu)化時(shí)，以什么為模板呢，含目的片段的質(zhì)粒？cDNA？還是基因組？還是都可以呢？ 熔接曲線能區(qū)分引物二聚體和非特異性條帶嗎？ |
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nininini(金幣+1):謝謝參與
nininini(金幣+6): 2011-04-07 10:36:07
nininini(金幣+1):謝謝參與
nininini(金幣+6): 2011-04-07 10:36:07
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通常不會用質(zhì)粒去優(yōu)化。 1. 不是每個(gè)基因你都有對應(yīng)的質(zhì)粒。 2. 質(zhì)粒優(yōu)化產(chǎn)生的PCR條件雖然大多數(shù)情況下可以直接用于cDNA或基因組PCR，但是你還需要做具體實(shí)驗(yàn)微環(huán)境下的標(biāo)準(zhǔn)曲線。reviewer 不會放你過關(guān)。意思就是你優(yōu)化完了條件，還要用cDNA或genomic做一次標(biāo)準(zhǔn)曲線，看看擴(kuò)增效率和線性范圍是否達(dá)到要求。 3. 純質(zhì)粒很難產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增，你不能檢測引物特異性。無法保證實(shí)驗(yàn)中不會產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增，如果有了非特異性擴(kuò)增，你必須改變條件，條件變了，又要重新優(yōu)化。 4. 逆轉(zhuǎn)錄價(jià)格并不貴。通常都是一次性反轉(zhuǎn)錄大量cDNA，然后酒精沉淀純化，分裝凍存，用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線和條件優(yōu)化。一次正交設(shè)計(jì)就能解決問題。 5. 質(zhì)粒需線性化才能達(dá)到理想擴(kuò)增效果。 |
7樓2011-04-06 23:11:20
西瓜
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nininini(金幣+1):謝謝參與
nininini(金幣+4): 2011-04-06 19:18:55
nininini(金幣+1):謝謝參與
nininini(金幣+4): 2011-04-06 19:18:55
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質(zhì)粒比cDNA和基因組DNA更容易獲得，所以要優(yōu)化PCR，可以用質(zhì)粒作模板。 融解曲線可以區(qū)分的。融解曲線的峰會告訴你有多少種產(chǎn)物，峰的位置(橫坐標(biāo)，溫度）指示了這些產(chǎn)物各自的熔解溫度。假如只有一個(gè)峰，就是特異產(chǎn)物啦（tm值符合設(shè)計(jì)引物時(shí)分析的結(jié)果）。引物二聚體因?yàn)槠涡。瑃m值也小，峰會比較靠前。非特異條帶則不一定。 因?yàn)樘禺惍a(chǎn)物得到的良好擴(kuò)增，所以它的峰是最高的（縱坐標(biāo)，熒光信號強(qiáng)度）。引物二聚體和非特異條帶的峰一般比較低。 |
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cnb19873樓2011-04-06 19:12:08
4樓2011-04-06 19:21:37
西瓜
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amisking(金幣+2, EPI+1): 鼓勵(lì)發(fā)帖交流。 2011-04-06 19:46:07
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差別不大，最關(guān)鍵的是cDNA要做反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄酶很貴啊……所以一般都用質(zhì)粒優(yōu)化。 如果用的是sybr green一類的熒光染料，引物二聚體會影響熒光定量PCR的結(jié)果的。sybr green可以非特異地和雙鏈DNA結(jié)合，不管是目的產(chǎn)物、引物二聚體還是非特異產(chǎn)物，都可以產(chǎn)生熒光信號，而儀器是不能區(qū)分它們的信號的，所以引物二聚體和非特異產(chǎn)物會干擾定量結(jié)果。 可以試著提高退火溫度，看看能不能減少引物二聚體。有沒有二聚體就看融解曲線好了，跑膠的話，看不出是殘余的引物還是引物二聚體。 |
5樓2011-04-06 19:32:57
簡單回復(fù)
2011-04-06 23:16
回復(fù)
nininini(金幣+1):謝謝參與
xiaogenv11樓
2011-04-09 09:57
回復(fù)
nininini(金幣+1):謝謝參與
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