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yananjizhu新蟲 (初入文壇)
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[交流]
【求助/交流】westernblot 已有5人參與
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各位蟲友： 大家好，想問(wèn)下做westernblot時(shí)上樣量一樣，為什么最后顯色時(shí)條帶的寬窄和明暗不一樣呢，是抗體假的不均勻，還是轉(zhuǎn)膜時(shí)轉(zhuǎn)到膜上的量就不一樣，或者還有其他的原因，謝謝指教 |
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yananjizhu
新蟲 (初入文壇)
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5樓2011-04-11 17:45:21
ujsyangyong
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小木蟲(金幣+0.5):給個(gè)紅包，謝謝回帖交流
西瓜(金幣+5): 鼓勵(lì)交流。很細(xì)致很專業(yè)。 2011-04-10 11:45:52
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西瓜(EPI+1): 鼓勵(lì)！ 2011-04-10 14:55:29
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這要看你每個(gè)泳道所上蛋白樣品中目的蛋白的表達(dá)量是否存在差異，如果確實(shí)存在差異，那么出現(xiàn)這種結(jié)果就是完全正常的。不過(guò)需要排除由于上樣、轉(zhuǎn)膜、孵育抗體以及顯色不均勻帶來(lái)的影響。我Wersternblot做過(guò)很多，總結(jié)了一些經(jīng)驗(yàn)，將上述步驟中可能產(chǎn)生偏差的解決方法總結(jié)如下： 上樣：上樣前先測(cè)定蛋白濃度，根據(jù)每泳道上樣蛋白總量相等的原則計(jì)算上樣體積，最好先染內(nèi)參驗(yàn)證一下是否每泳道一致。 轉(zhuǎn)膜：確保膠與膜之間平整接觸，不要留有氣泡，濾紙要平整光滑，在膠上蓋膜的時(shí)候，將膜用轉(zhuǎn)膜緩沖液浸濕，采用平推的方式可以避免氣泡產(chǎn)生。 孵育抗體：膜不要太大，能覆蓋目的條帶的最小面積就可以了，孵育抗體的時(shí)候最好是將膜完整的泡在抗體稀釋液中（比較燒錢，國(guó)內(nèi)一般都不會(huì)這么做），我們是用封口膜繃在96孔板上，然后將抗體加在封口膜上，依靠液體的表面張力，會(huì)形成露珠狀，然后將封閉后的膜用濾紙吸干（一定要吸干），將蛋白面反扣在抗體稀釋液上，避免抗體跑到膜的背面，這樣整張膜就完全漂浮在抗體上，如果抗體跑到膜的反面，則膜可能由于重量沉下去，與封口膜緊貼，緊貼部分抗體孵育就不足，當(dāng)然就會(huì)產(chǎn)生條帶染色較淺的現(xiàn)象了。 加發(fā)光劑：方法同加抗體，也可以蛋白面朝上，將發(fā)光劑滴加在膜表面，對(duì)著光看一下是不是整張膜都被發(fā)光劑覆蓋了。 其中抗體孵育緩解是最容易對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響的，主要注意以下三點(diǎn)： 1.在允許的情況下盡量減少膜的面積，減輕膜的自重和抗體用量 2.還有上抗體前將膜吸干可以避免抗體跑到膜的背面 3.抗體量不能太少，一般25平方厘米的膜抗體稀釋液用量在1.5ml左右 |
2樓2011-04-10 11:33:10
75372017
木蟲 (初入文壇)
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3樓2011-04-10 17:34:49
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4樓2011-04-10 18:24:36
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