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starfishfly銅蟲 (初入文壇)
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[交流]
【求助/交流】單酶切酶和DNA的比例，體系大小的問題 已有5人參與
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酶切體系是越大越好嗎？ 為什么我用EcoR I酶切，20ul體系加0.5ul酶的時候效果比200ul體系加2ul酶效果好？ 而且昨天用200ul體系切10ul的DNA沒有切5ulDNA效果好 |
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小木蟲(金幣+0.5):給個紅包，謝謝回帖交流
西瓜(金幣+5, EPI+1): 最近很給力�。� 2011-04-14 12:06:23
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西瓜(金幣+5, EPI+1): 最近很給力�。� 2011-04-14 12:06:23
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1.關(guān)于酶切體系：適當(dāng)增加酶切體系是好的，因為限制性內(nèi)切酶只有在自己的最適環(huán)境里才能完全發(fā)揮它的酶切能力，那么這個環(huán)境是由buffer來提供的，適當(dāng)增大酶切體系可以減少因為移液槍精度或是個人操作所引起的實驗誤差，有利于限制性內(nèi)切酶發(fā)揮其最大的酶切活性，但是由于增加酶切體系所隨之帶來的問題是限制性內(nèi)切酶在體系當(dāng)中濃度的降低，使得酶與酶切位點結(jié)合的幾率也會有一定的下降；所以并非體系越大越好 2.關(guān)于酶切體系的確定：酶的用量是由底物的量來確定的，一般來講1ul酶可以切割1ug的底物（最適條件下，1h）；由酶的量來確定酶切體系的大小，一般1ul酶對應(yīng)20ul的酶切體系；由酶切體系確定buffer和水的量 3.關(guān)于根據(jù)酶的用量來確定酶切體系：酶切體系的確立是為了給酶提供一個最適的反應(yīng)環(huán)境。酶都是保存在甘油里的（50%），而較高的甘油濃度對任何限制性內(nèi)切酶的特異性切割都是不利的（產(chǎn)生星活性），正常情況下把酶稀釋10倍后就可以忽略此因素的影響，再結(jié)合前面提到的適當(dāng)增大酶切體系的原則，經(jīng)過實踐證明1ul酶對應(yīng)20ul的酶切體系是個不錯的選擇 |
3樓2011-04-14 11:18:58
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7樓2011-04-14 12:06:02
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dhd997(金幣+6): good 2011-04-14 13:56:58
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dhd997(金幣+6): good 2011-04-14 13:56:58
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看你說的效果是指什么了，切割速度？切割是否完全？ 一方面，酶切也是化學(xué)反應(yīng)，反應(yīng)速度當(dāng)然跟底物濃度相關(guān)，而且酶在稀溶液里的穩(wěn)定性要差，過于稀的話可以考慮加點BSA。 另一方面，DNA純度也影響切割，一般小提的質(zhì)粒純度都很差的，體系大一些相對好 另外EcoR I本身也比較特殊，酶多了不好 不過一般體系大小影響不會很明顯，基本上是個人習(xí)慣。有的人就習(xí)慣用10 uL的小體系，我就不習(xí)慣用50 uL以下的體系。在樣品、酶質(zhì)量都好的情況下基本也不會出問題 |
2樓2011-04-14 11:05:30
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4樓2011-04-14 11:45:25
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5樓2011-04-14 11:49:52
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6樓2011-04-14 11:52:57
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8樓2011-04-14 12:07:22
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9樓2011-04-14 12:07:46
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dhd997(金幣+5): 繼續(xù)努力 2011-04-14 13:57:18
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dhd997(金幣+5): 繼續(xù)努力 2011-04-14 13:57:18
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同一個體系的意思，是說里面各種成分的濃度一樣。大體系、小體系，并不是說濃度不一樣，而是說總的反應(yīng)規(guī)模的大小。 大體系酶切，是因為酶切之后往往做膠回收等純化，中間DNA損失比較多。所以開始切的DNA的量要多些（并等比例增加酶、buffer等成分），才能保證后續(xù)步驟有足量的DNA。 小體系連接，是因為連接產(chǎn)物需要量不多。轉(zhuǎn)化的話，一點點連接產(chǎn)物就夠了。所以，連接的DNA量不多，相應(yīng)的buffer、酶用量就不多，就是說用小體系就足夠了。 [ Last edited by 西瓜 on 2011-4-14 at 16:02 ] |
10樓2011-04-14 12:15:34
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