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starfishfly銅蟲(chóng) (初入文壇)
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[交流]
【求助/交流】單酶切酶和DNA的比例，體系大小的問(wèn)題 已有5人參與
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酶切體系是越大越好嗎？ 為什么我用EcoR I酶切，20ul體系加0.5ul酶的時(shí)候效果比200ul體系加2ul酶效果好？ 而且昨天用200ul體系切10ul的DNA沒(méi)有切5ulDNA效果好 |
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空谷幽風(fēng)
金蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
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小木蟲(chóng)(金幣+0.5):給個(gè)紅包，謝謝回帖交流
西瓜(金幣+5, EPI+1): 最近很給力啊！ 2011-04-14 12:06:23
小木蟲(chóng)(金幣+0.5):給個(gè)紅包，謝謝回帖交流
西瓜(金幣+5, EPI+1): 最近很給力啊！ 2011-04-14 12:06:23
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1.關(guān)于酶切體系：適當(dāng)增加酶切體系是好的，因?yàn)橄拗菩詢?nèi)切酶只有在自己的最適環(huán)境里才能完全發(fā)揮它的酶切能力，那么這個(gè)環(huán)境是由buffer來(lái)提供的，適當(dāng)增大酶切體系可以減少因?yàn)橐埔簶尵然蚴莻�(gè)人操作所引起的實(shí)驗(yàn)誤差，有利于限制性內(nèi)切酶發(fā)揮其最大的酶切活性，但是由于增加酶切體系所隨之帶來(lái)的問(wèn)題是限制性內(nèi)切酶在體系當(dāng)中濃度的降低，使得酶與酶切位點(diǎn)結(jié)合的幾率也會(huì)有一定的下降；所以并非體系越大越好 2.關(guān)于酶切體系的確定：酶的用量是由底物的量來(lái)確定的，一般來(lái)講1ul酶可以切割1ug的底物（最適條件下，1h）；由酶的量來(lái)確定酶切體系的大小，一般1ul酶對(duì)應(yīng)20ul的酶切體系；由酶切體系確定buffer和水的量 3.關(guān)于根據(jù)酶的用量來(lái)確定酶切體系：酶切體系的確立是為了給酶提供一個(gè)最適的反應(yīng)環(huán)境。酶都是保存在甘油里的（50%），而較高的甘油濃度對(duì)任何限制性內(nèi)切酶的特異性切割都是不利的（產(chǎn)生星活性），正常情況下把酶稀釋10倍后就可以忽略此因素的影響，再結(jié)合前面提到的適當(dāng)增大酶切體系的原則，經(jīng)過(guò)實(shí)踐證明1ul酶對(duì)應(yīng)20ul的酶切體系是個(gè)不錯(cuò)的選擇 |
3樓2011-04-14 11:18:58
ben1147
木蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
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小木蟲(chóng)(金幣+0.5):給個(gè)紅包，謝謝回帖交流
dhd997(金幣+6): good 2011-04-14 13:56:58
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dhd997(金幣+6): good 2011-04-14 13:56:58
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看你說(shuō)的效果是指什么了，切割速度？切割是否完全？ 一方面，酶切也是化學(xué)反應(yīng)，反應(yīng)速度當(dāng)然跟底物濃度相關(guān)，而且酶在稀溶液里的穩(wěn)定性要差，過(guò)于稀的話可以考慮加點(diǎn)BSA。 另一方面，DNA純度也影響切割，一般小提的質(zhì)粒純度都很差的，體系大一些相對(duì)好 另外EcoR I本身也比較特殊，酶多了不好 不過(guò)一般體系大小影響不會(huì)很明顯，基本上是個(gè)人習(xí)慣。有的人就習(xí)慣用10 uL的小體系，我就不習(xí)慣用50 uL以下的體系。在樣品、酶質(zhì)量都好的情況下基本也不會(huì)出問(wèn)題 |
2樓2011-04-14 11:05:30
starfishfly
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4樓2011-04-14 11:45:25
starfishfly
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5樓2011-04-14 11:49:52
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