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b529941390木蟲 (正式寫手)
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[求助]
關(guān)于質(zhì)粒提取
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最近問老外要了個質(zhì)粒，他們在大腸桿菌DH5α里面做的表達。 拿到質(zhì)粒之后，做了PCR，看到條帶和目的片段的大小相同，然后就將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到了買好的DH5α感受態(tài)細胞中，涂板之后挑取單菌落，菌落PCR和提取的質(zhì)粒做PCR都有條帶，下面是PCR產(chǎn)物的電泳圖，從左到右一次是陰性對照，陽性對照，三個樣品和一個marker 但是現(xiàn)在遇到了一個問題： 我的質(zhì)粒提取的濃度很低很低！ 嘗試著用了2mL、10mL和30mL的菌液提取質(zhì)粒，但是質(zhì)粒的濃度都很低！ 使用的洗脫液的體積是30uL，跑了1uL的DNA電泳，除了10mL的有很弱的條帶之外，其它的都沒有條帶，后來我去別的實驗室借了一個正常的高拷貝菌，作為陽性對照，再次提取質(zhì)粒，發(fā)現(xiàn)陽性對照出來了，但是我的質(zhì)粒還是看不到！ 下面是10mL的菌液提取質(zhì)粒后的DNA電泳圖，從左到右一次是兩個marker和三個樣品，可以很艱難的看到在最大bp上面>500bp,的地方，樣品有弱條帶(質(zhì)�？偞笮〈蟾攀�5000-6000bp) 然后我又將高拷貝質(zhì)粒的細菌作為陽性對照，同樣提取質(zhì)粒，然后做了DNA電泳： 左邊兩個是marker，0#就是我的陽性對照的高拷貝菌提取的質(zhì)粒，后面都是樣品 可以看到，基本上看不到樣品質(zhì)粒的條帶，然后就沒有辦法測序。 現(xiàn)在我的問題是： 我的質(zhì)粒拷貝數(shù)很低，提出的質(zhì)粒濃度那么低，怎么測序呢？如果不能測序，我能往下做誘導(dǎo)么？ 還有就是，如果質(zhì)粒的拷貝數(shù)這么低，那么我將來做誘導(dǎo)表達的時候，還能夠在DH5α里面做么？ 期待高手回復(fù)，謝謝！ |
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【答案】應(yīng)助回帖
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b529941390(金幣+50): 10 2011-04-18 13:42:24
dhd997(金幣+6, EPI+1): good 2011-04-18 14:37:41
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dhd997(金幣+6, EPI+1): good 2011-04-18 14:37:41
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可以，表達最常用的pET系統(tǒng)，拷貝數(shù)就很低，但是完全不限制他的廣泛使用 想要提高質(zhì)粒提取濃度，也有辦法 1.小提上多摸索一些條件，感覺養(yǎng)菌時間有時候?qū)|(zhì)粒提取的影響不小。 2.可以搖幾個小時后，加一點氯霉素，可以比較明顯的增加提取量。 3.真不行，就多提幾管，然后乙醇沉淀，濃縮。 另外，測序，沒問題，把菌給公司，讓他們提質(zhì)粒測序，測不出來使他們的事情。另外低拷貝測序沒什么問題 再附，能不能在DH5a表達，與拷貝數(shù)無關(guān)，和質(zhì)粒上的啟動子之類元件有關(guān)。很多載體都可以在DH5a中表達，當(dāng)然作為常見的克隆宿主菌，它并不一定是表達最合適的菌株 |
2樓2011-04-18 13:09:31
b529941390
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3樓2011-04-18 13:45:24
roomofxw
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dhd997(金幣+5): good 2011-04-18 18:48:24
dhd997(金幣+5): good 2011-04-18 18:48:24
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哦，你是說takara是吧，那也沒問題，我在北京也是用寶生物測序的，低拷貝的pET載體，提了一點質(zhì)粒給他們，由他們轉(zhuǎn)化后，再提取質(zhì)粒測序的。 DH5a一般是作為克隆宿主，但是也能表達用，和質(zhì)粒有關(guān)了 您要使用pET，那一般采用BL21(DE3)類的 pGEX，一般也用BL21 pQE系列，就是M15菌了 我用過pBAD系列的質(zhì)粒，放在DH5a表達，也很OK，表達量沒有問題。 但是基本原理，還是需要試驗驗證，您只有做了才知道。表達和質(zhì)粒，宿主，基因，蛋白，表達條件等都很有關(guān)系，不好說 |
4樓2011-04-18 13:57:49
b529941390
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6樓2011-04-18 14:46:52
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7樓2011-05-03 14:50:56
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8樓2011-05-03 15:58:25
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