 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 分子生物 » 綜合其他 » 關于質粒提取
| 8 | 1/1 | 返回列表 |
| 查看: 1829 | 回復: 7 | |||
| 本帖產(chǎn)生 1 個 MolEPI ，點擊這里進行查看 | |||
b529941390木蟲 (正式寫手)
|
[求助]
關于質粒提取
|
||
|
最近問老外要了個質粒，他們在大腸桿菌DH5α里面做的表達。 拿到質粒之后，做了PCR，看到條帶和目的片段的大小相同，然后就將質粒轉化到了買好的DH5α感受態(tài)細胞中，涂板之后挑取單菌落，菌落PCR和提取的質粒做PCR都有條帶，下面是PCR產(chǎn)物的電泳圖，從左到右一次是陰性對照，陽性對照，三個樣品和一個marker 但是現(xiàn)在遇到了一個問題： 我的質粒提取的濃度很低很低！ 嘗試著用了2mL、10mL和30mL的菌液提取質粒，但是質粒的濃度都很低！ 使用的洗脫液的體積是30uL，跑了1uL的DNA電泳，除了10mL的有很弱的條帶之外，其它的都沒有條帶，后來我去別的實驗室借了一個正常的高拷貝菌，作為陽性對照，再次提取質粒，發(fā)現(xiàn)陽性對照出來了，但是我的質粒還是看不到！ 下面是10mL的菌液提取質粒后的DNA電泳圖，從左到右一次是兩個marker和三個樣品，可以很艱難的看到在最大bp上面>500bp,的地方，樣品有弱條帶(質�？偞笮〈蟾攀�5000-6000bp) 然后我又將高拷貝質粒的細菌作為陽性對照，同樣提取質粒，然后做了DNA電泳： 左邊兩個是marker，0#就是我的陽性對照的高拷貝菌提取的質粒，后面都是樣品 可以看到，基本上看不到樣品質粒的條帶，然后就沒有辦法測序。 現(xiàn)在我的問題是： 我的質�？截悢�(shù)很低，提出的質粒濃度那么低，怎么測序呢？如果不能測序，我能往下做誘導么？ 還有就是，如果質粒的拷貝數(shù)這么低，那么我將來做誘導表達的時候，還能夠在DH5α里面做么？ 期待高手回復，謝謝！ |
回復此樓» 猜你喜歡
不合理蛙科研實驗中的趣事：實驗器材的 “烏龍”
已經(jīng)有0人回復
-
不合理蛙科研實驗中的趣事：和實驗材料的 “斗智斗勇”
已經(jīng)有0人回復
-
化學工程及工業(yè)化學論文潤色/翻譯怎么收費?
已經(jīng)有176人回復
-
蛋白質檢測：精準分析，解鎖生物分子的密碼
已經(jīng)有0人回復
-
不合理蛙科研實驗之小鼠實驗：嚴謹設計，解析生命機制的重要載體
已經(jīng)有0人回復
-
不合理蛙科研實驗之重金屬檢測：精準篩查，守護健康與環(huán)境的防線
已經(jīng)有0人回復
-
不合理蛙科研實驗之“蛙測重金屬我背鍋三千”
已經(jīng)有0人回復
-
不合理蛙科研實驗之“鼠逃三次我發(fā)三篇SCI”
已經(jīng)有0人回復
-
納米粒度分析
已經(jīng)有3人回復
-
林科院林化所招收材料與化工專業(yè)碩士，坐標南京
已經(jīng)有0人回復
» 本主題相關價值貼推薦，對您同樣有幫助:
- 請教：關于堿式抽提質粒
已經(jīng)有5人回復
- 質粒DNA提取成了這樣，請大家?guī)兔Ψ治鲆幌?/a>
已經(jīng)有27人回復
- 求助關于質粒提取的若干問題，謝謝了��！
已經(jīng)有5人回復
- 質粒提取瓊脂糖電泳的3個條帶，到底每條是什么？
已經(jīng)有15人回復
- 質粒提取
已經(jīng)有22人回復
- 【求助/交流】質粒提取
已經(jīng)有21人回復
- 【求助/交流】質粒提取的雜質去除問題
已經(jīng)有14人回復
roomofxw
木蟲 (正式寫手)
- MolEPI: 5
- 應助: 13 (小學生)
- 貴賓: 0.005
- 金幣: 2882.1
- 散金: 69
- 紅花: 7
- 帖子: 755
- 在線: 1020小時
- 蟲號: 812203
- 注冊: 2009-07-20
- 專業(yè): 生物化學
【答案】應助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★
b529941390(金幣+50): 10 2011-04-18 13:42:24
dhd997(金幣+6, EPI+1): good 2011-04-18 14:37:41
b529941390(金幣+50): 10 2011-04-18 13:42:24
dhd997(金幣+6, EPI+1): good 2011-04-18 14:37:41
|
可以，表達最常用的pET系統(tǒng)，拷貝數(shù)就很低，但是完全不限制他的廣泛使用 想要提高質粒提取濃度，也有辦法 1.小提上多摸索一些條件，感覺養(yǎng)菌時間有時候對質粒提取的影響不小。 2.可以搖幾個小時后，加一點氯霉素，可以比較明顯的增加提取量。 3.真不行，就多提幾管，然后乙醇沉淀，濃縮。 另外，測序，沒問題，把菌給公司，讓他們提質粒測序，測不出來使他們的事情。另外低拷貝測序沒什么問題 再附，能不能在DH5a表達，與拷貝數(shù)無關，和質粒上的啟動子之類元件有關。很多載體都可以在DH5a中表達，當然作為常見的克隆宿主菌，它并不一定是表達最合適的菌株 |
2樓2011-04-18 13:09:31
b529941390
木蟲 (正式寫手)
- 應助: 3 (幼兒園)
- 金幣: 1825.7
- 散金: 179
- 紅花: 3
- 帖子: 816
- 在線: 208.2小時
- 蟲號: 556994
- 注冊: 2008-05-11
- 專業(yè): 色譜分析
3樓2011-04-18 13:45:24
roomofxw
木蟲 (正式寫手)
- MolEPI: 5
- 應助: 13 (小學生)
- 貴賓: 0.005
- 金幣: 2882.1
- 散金: 69
- 紅花: 7
- 帖子: 755
- 在線: 1020小時
- 蟲號: 812203
- 注冊: 2009-07-20
- 專業(yè): 生物化學
【答案】應助回帖
★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金幣+5): good 2011-04-18 18:48:24
dhd997(金幣+5): good 2011-04-18 18:48:24
|
哦，你是說takara是吧，那也沒問題，我在北京也是用寶生物測序的，低拷貝的pET載體，提了一點質粒給他們，由他們轉化后，再提取質粒測序的。 DH5a一般是作為克隆宿主，但是也能表達用，和質粒有關了 您要使用pET，那一般采用BL21(DE3)類的 pGEX，一般也用BL21 pQE系列，就是M15菌了 我用過pBAD系列的質粒，放在DH5a表達，也很OK，表達量沒有問題。 但是基本原理，還是需要試驗驗證，您只有做了才知道。表達和質粒，宿主，基因，蛋白，表達條件等都很有關系，不好說 |
4樓2011-04-18 13:57:49
b529941390
木蟲 (正式寫手)
- 應助: 3 (幼兒園)
- 金幣: 1825.7
- 散金: 179
- 紅花: 3
- 帖子: 816
- 在線: 208.2小時
- 蟲號: 556994
- 注冊: 2008-05-11
- 專業(yè): 色譜分析
5樓2011-04-18 14:30:59
roomofxw
木蟲 (正式寫手)
- MolEPI: 5
- 應助: 13 (小學生)
- 貴賓: 0.005
- 金幣: 2882.1
- 散金: 69
- 紅花: 7
- 帖子: 755
- 在線: 1020小時
- 蟲號: 812203
- 注冊: 2009-07-20
- 專業(yè): 生物化學
6樓2011-04-18 14:46:52
b529941390
木蟲 (正式寫手)
- 應助: 3 (幼兒園)
- 金幣: 1825.7
- 散金: 179
- 紅花: 3
- 帖子: 816
- 在線: 208.2小時
- 蟲號: 556994
- 注冊: 2008-05-11
- 專業(yè): 色譜分析
7樓2011-05-03 14:50:56
nuoyaeva
鐵桿木蟲 (正式寫手)
- MolEPI: 2
- 應助: 9 (幼兒園)
- 金幣: 5132.8
- 帖子: 446
- 在線: 561.5小時
- 蟲號: 877127
- 注冊: 2009-10-19
- 性別: GG
- 專業(yè): 腫瘤化學藥物治療
8樓2011-05-03 15:58:25
相關版塊跳轉
我要訂閱樓主 b529941390 的主題更新
| 8 | 1/1 | 返回列表 |
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 306求調(diào)劑 +4 | 來好運來來來 2026-03-22 | 4/200 |
|
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 考研調(diào)劑 +4 | 來好運來來來 2026-03-21 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 354求調(diào)劑 +7 | Tyoumou 2026-03-18 | 10/500 |
|
|
|
[考研] 08工科 320總分 求調(diào)劑 +7 | 梨花珞晚風 2026-03-17 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 0856材料專碩353求調(diào)劑 +4 | NIFFFfff 2026-03-20 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 生物學071000 329分求調(diào)劑 +4 | 我愛生物生物愛?/a> 2026-03-17 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 286求調(diào)劑 +10 | Faune 2026-03-21 | 10/500 |
|
|
|
[考研] 材料工程專碩 348分求調(diào)劑 +3 | 冬辭. 2026-03-17 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 297求調(diào)劑 +3 | 喜歡還是不甘心 2026-03-20 | 3/150 |
|
|
|
[基金申請]
學校已經(jīng)提交到NSFC，還能修改嗎？
 40+4
|
babangida 2026-03-19 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 0805材料320求調(diào)劑 +3 | 深海物語 2026-03-20 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 求調(diào)劑 +3 | 白QF 2026-03-21 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 316求調(diào)劑 +6 | 梁茜雯 2026-03-19 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 求調(diào)劑 +3 | Ma_xt 2026-03-17 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 307求調(diào)劑 +10 | 冷笙123 2026-03-17 | 10/500 |
|
|
|
[考研] 材料專業(yè)求調(diào)劑 +6 | hanamiko 2026-03-18 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 288求調(diào)劑 +16 | 于海海海海 2026-03-19 | 16/800 |
|
|
|
[考研] 260求調(diào)劑 +3 | 朱芷琳 2026-03-20 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 085601專碩，總分342求調(diào)劑，地區(qū)不限 +5 | share_joy 2026-03-16 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 考研調(diào)劑 +3 | 淇ya_~ 2026-03-17 | 5/250 |
|