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[求助]
定量pcr的污染問題
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大家好！最近在做定量，但是不知道什么原因空白對(duì)照也出現(xiàn)擴(kuò)增。情況是這樣的：我用CDNA模板做了5個(gè)梯度稀釋，準(zhǔn)備先做標(biāo)準(zhǔn)曲線。出來的結(jié)果濃度大的3個(gè)模板擴(kuò)增曲線的ct值都相隔一定值，比較正常；濃度小的那2個(gè)曲線較接近了；而且那個(gè)空白對(duì)照也有擴(kuò)增。 我分析應(yīng)該不會(huì)是二聚體，因?yàn)槿芙馇�只有一個(gè)峰，而且擴(kuò)增曲線隨著模板濃度的減小而后移。大覺覺得是這樣嗎？ 我先以為是氣溶膠污染，然后換了個(gè)地方做，還是有陰性擴(kuò)增 后來我去別人的實(shí)驗(yàn)室做，用的人家的槍和實(shí)驗(yàn)室，就沒有擴(kuò)增了 所以我覺得可能是我的槍污染了，我同學(xué)的實(shí)驗(yàn)室不方便去了，我換了個(gè)從沒做過分子實(shí)驗(yàn)的地方做，又換了我實(shí)驗(yàn)室的別的槍做，還是有陰性擴(kuò)增 最后我買了那種帶濾膜的槍頭，不知道大家用過嗎？就是槍頭上有那種濾膜，說是可以防污染的，用了之后還是有陰性擴(kuò)增。 請(qǐng)問誰知道怎么辦啊？或者幫我出出主意啊，我實(shí)在是沒辦法了，每次都有擴(kuò)增。謝謝大家?guī)兔Γ? |
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【答案】應(yīng)助回帖
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有時(shí)候引物不好，用水做模板也會(huì)看到有擴(kuò)增。一般，陰性對(duì)照35個(gè)循環(huán)之后才出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，也算是正常的啦。 “我分析應(yīng)該不會(huì)是二聚體，因?yàn)槿芙馇�只有一個(gè)峰，而且擴(kuò)增曲線隨著模板濃度的減小而后移。”這個(gè)分析是正確的。 “濃度小的那2個(gè)曲線較接近了”有可能是稀釋濃度太低了。如果到30個(gè)循環(huán)之后才出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，最好考慮采用濃度更大的點(diǎn)來做標(biāo)準(zhǔn)曲線。 |
5樓2011-04-19 14:15:51
lanhuaorchid
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6樓2012-03-27 16:26:39
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