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xiajing_acm新蟲 (小有名氣)
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[求助]
關(guān)于MTT加液與棄液的一些思考與疑問(wèn)
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給位大俠： 你們好，小弟要著手MTT，里面有些問(wèn)題不太清楚，請(qǐng)給位指點(diǎn)： 1、種板時(shí)我每孔打算加100μl 共5000個(gè)左右細(xì)胞，等細(xì)胞貼壁后需不需要把培養(yǎng)液吸出之后再加入100μl 的藥液呢？我看有的資料上說(shuō)直接加入100μl藥液維持到200μl的體系，可是我是按照100μl體系來(lái)算的加藥量啊，如果不吸走里面原有的100μl培養(yǎng)液的話，那我的藥物濃度豈不被稀釋了一倍嗎？ 2、加藥處理適當(dāng)時(shí)間后，在加MTT需不需要把里面的培養(yǎng)液吸出來(lái)呢？若吸出來(lái)的話，那么是直接加入20μl 的5mg/ml的MTT呢，還是需要加入180μl新鮮的培養(yǎng)液+20μl 5mg/ml的MTT呢？是用含血清的培養(yǎng)基還是不含血清的？ 3、加DMSO之前需要吸走培養(yǎng)液吧？給位戰(zhàn)友是怎么操作才能保證不把甲瓚結(jié)晶吸走呢？需要在平板離心機(jī)上離心嗎？ 4、上酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)到底選擇多少合適呢？490還是570nm呢？還需要設(shè)630nm參比波長(zhǎng)嗎？參比波長(zhǎng)作用是什么呢？怎么用它的數(shù)據(jù)呢？ 非常感謝各位大俠，盼早日解決！祝各位一切順利！ |
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2樓2011-04-22 09:08:50
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【答案】應(yīng)助回帖
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karl2100(金幣+1): 謝謝回帖！ 2011-04-24 19:07:52
xiajing_acm(金幣+5): 2011-04-27 19:42:28
qinhy(EPI+1): O(∩_∩)O謝謝 2011-05-01 08:01:45
karl2100(金幣+1): 謝謝回帖！ 2011-04-24 19:07:52
xiajing_acm(金幣+5): 2011-04-27 19:42:28
qinhy(EPI+1): O(∩_∩)O謝謝 2011-05-01 08:01:45
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1.這個(gè)主要看你的藥物性質(zhì)以及培養(yǎng)時(shí)間,因?yàn)樵谂囵B(yǎng)基中存在的血清,成分復(fù)雜,有時(shí)會(huì)干擾MTT結(jié)果,所以需要吸出原培養(yǎng)液后再給藥,但也有一種可能,即培養(yǎng)時(shí)間比較長(zhǎng),細(xì)胞個(gè)數(shù)大則會(huì)把培養(yǎng)液中所含有的血清消耗掉,這樣就不用換液了,對(duì)于后半個(gè)問(wèn)題,你加倍濃度不就OK了嗎? 2.如果細(xì)胞帖的緊,一般來(lái)說(shuō)要把原液吸出去,否則MTT會(huì)與一些藥物形成二聚體影響結(jié)果.用不含血清的培養(yǎng)基采用后一種辦法加入. 3.這個(gè)是肯定得吸走的啊,我做過(guò)SY5Y,直接把板子倒過(guò)來(lái),扣去液體即可.沒(méi)試過(guò)離心,但原理上應(yīng)該可以. 4.不需要參比波長(zhǎng),490-570都行,看你的顏色深淺而定 僅供參考嘿嘿 |
3樓2011-04-22 14:21:57
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4樓2011-04-22 15:07:37
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【答案】應(yīng)助回帖
qinhy(EPI+1): 2011-05-01 08:01:56
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1、你可以吸出50，再加入50ul新的培養(yǎng)基，其中藥物濃度翻倍。 2、一般不用吸出原來(lái)的培養(yǎng)基，直接加入10ulMTT即可。 3、這個(gè)問(wèn)題要看細(xì)胞貼壁牢固程度了，想前面那位大俠，細(xì)胞貼壁牢固，直接把板反過(guò)來(lái)，下面墊無(wú)菌吸紙，培養(yǎng)基就會(huì)被自動(dòng)吸走；如果細(xì)胞貼壁不牢固，那你就要考慮把板傾斜了，把其中的培養(yǎng)基輕輕吸出來(lái)，但是要注意，tips頭部不要碰到板的地步，否則會(huì)吧細(xì)胞粘下來(lái)。還有些懸浮細(xì)胞MTT時(shí)，直接往里面加入裂解液了，也是可以把甲瓚溶解的。 4，一般選擇490nm波長(zhǎng)。 |
5樓2011-04-22 15:47:07
Chlo_Q
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【答案】應(yīng)助回帖
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karl2100(金幣+1): 謝謝您的回復(fù)！ 2011-04-24 19:08:12
xiajing_acm(金幣+5): 2011-04-27 19:42:39
qinhy(EPI+1): 2011-05-01 08:02:06
karl2100(金幣+1): 謝謝您的回復(fù)！ 2011-04-24 19:08:12
xiajing_acm(金幣+5): 2011-04-27 19:42:39
qinhy(EPI+1): 2011-05-01 08:02:06
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首先，我也考慮過(guò)這個(gè)問(wèn)題1，最后的解決方案是將藥物配成100倍液，加的時(shí)候我就直接往100里加1微升了。主要考慮的不是藥的濃度問(wèn)題，因?yàn)檫@要確定好之后才好配的，而是控制變量的問(wèn)題，體積大了，細(xì)胞的環(huán)境就不同了。。。 2.MTT的原理你有沒(méi)有了解，它是靠活細(xì)胞的酶反應(yīng)，我認(rèn)為，不要餓著它了，原來(lái)是什么培養(yǎng)液就繼續(xù)用那個(gè)，如果不是培養(yǎng)了太久，就直接加MTT了（除非，你的藥物具有還原性�。。� 3.論壇里有一帖，很詳細(xì)的講了MTT法，里面有，建議搜一下看看，我看了很受用 4.我用著的是570測(cè)定，630參比。沒(méi)方法，還是貼個(gè)鏈接你吧，http://www.biomart.cn/experiment/430/488/498/17544_1.htm 其他論壇上的，說(shuō)法有多種，僅供參考 |
6樓2011-04-24 11:06:19
7樓2011-08-20 14:04:34
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