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waiwaidou_1983銅蟲 (小有名氣)
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[求助]
Elisa 包被
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蛋白標準樣品等點電是5 用9.6的碳酸鹽緩沖液包被，檢測樣品每次都顯色，就是標準樣品不顯色 將蛋白標準樣品 做點雜也沒問題，推測應該是包被有問題，但是不知道怎么解決 標準樣品 最高濃度的每個孔包被了3.5 ug 然后2倍的逐漸稀釋 7次 |
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【答案】應助回帖
★ ★
reasonspare(金幣+2, EPI+1): 謝謝分享 2011-04-26 11:14:36
reasonspare(金幣+2, EPI+1): 謝謝分享 2011-04-26 11:14:36
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蛋白標準樣品等點電是5 用9.6的碳酸鹽緩沖液包被 等點電是5 9.6的碳酸鹽緩沖液的9.6只是PH值 根據等電點的定義：由于蛋白質表面離子化側鏈的存在，蛋白質帶凈電荷。由于這些側鏈都是可以滴定的（titratable），對于每個蛋白都存在一個pH使它的表面凈電荷為零即等電點。 所以你的蛋白標準品用碳酸鹽緩沖液包被包被時整個體系的PH是不再是9.6的 應該比9.6小了很多了 蛋白和聚苯乙烯板子結合的詳細過程目前上不是很明了，目前認為是通過靜電吸附在板子上的，而聚苯乙烯板子一般在出廠前也要經過強電廠處理以提高吸附能力！肯定和蛋白的帶電情況有關，包被緩沖液并不一定都是PH9.6 的CB，不同的蛋白選用不同的包被緩沖液可以得最佳的包被效果，從上面可以看出和蛋白的帶電情況有明顯的相關性！ 為什么緩沖液的PH要大于包被蛋白的PI，原因有兩點： 一是因為蛋白質與酶標板的結合主要是靠疏水作用的物理吸附。而緩沖液的PH略大于包被蛋白的PI，有利于蛋白質疏水鍵的適當暴露。 二是因為酶標板聚苯乙烯表面暴露的主要是C－H鍵，而緩沖液的PH略大于包被蛋白的PI，可以使蛋白質帶上負電荷，有利于蛋白質與酶標板的牢固結合，提高包被效率。所以我們常用的包被液體多位PH9.6的碳酸氫鈉緩沖液，當然對PI低的蛋白質也有使用PH7.4的包被液的情況。 總之，一句話，不是所有蛋白樣品做ELISA的時候用9.6的碳酸鹽緩沖液包被都會有好的結果的，這個時候就需要摸索更好的抗原包被液 |
2樓2011-04-26 09:53:04
waiwaidou_1983
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3樓2011-04-26 14:28:39
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4樓2011-04-27 12:48:14
waiwaidou_1983
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5樓2011-04-29 14:44:46
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【答案】應助回帖
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waiwaidou_1983(金幣+15): 非常感謝，我再試試 2011-05-03 08:12:52
lstt09nk(金幣+8): 很熱心 2011-05-04 17:46:12
waiwaidou_1983(金幣+15): 非常感謝，我再試試 2011-05-03 08:12:52
lstt09nk(金幣+8): 很熱心 2011-05-04 17:46:12
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等電點是5的話 估計一加抗原的時候PH就會比緩沖液的PH低很多了 這個時候我覺得可能碳酸鹽緩沖液的緩沖能力是肯定不夠的了 要是PBS包被的效果也不行的話 可以考慮購買試劑公司的包被液了 畢竟ELISA也就是檢測方法 不值當我們?yōu)榱诉@樣一個實驗來反復摸索優(yōu)化耗時太多 可以像試劑公司購買專門用于PI比較低的抗原的ELISA包被液 先跟他們講清楚咱的蛋白PI是5 要做ELISA 要他們推薦一種適用于低PI的蛋白效果好的包被液 可以先要求給個試用裝試試 好用再買 不好用或者不給就換一家‘ 試劑公司嘛現在滿地都是 祝你好運了 |
6樓2011-04-30 16:51:09
gongeleven
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7樓2011-04-30 17:50:19
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