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dhmdddd木蟲 (正式寫手)
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[求助]
請教關(guān)于寶公司pMD18T連接問題
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用pMD18T連接PCR產(chǎn)物，老是連不上，最開始只知道利用的是polyA和載體上的T連接起來，今天看了看T載的說明書感到有點小疑惑，連接做了幾次，單跑質(zhì)粒的后就是話感覺大小是對的，但是酶切后面再看就不對了，這是不是壓根就沒有連上？還是什么情況？求解釋……補充一下，我的目的基因兩邊的酶切位點是EcoR I 和BamH I [ Last edited by dhmdddd on 2011-4-26 at 15:51 ] |
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liu_juan82
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★
lstt09nk(金幣+3): 很積極，很熱心~~ 2011-04-26 22:55:14
dhmdddd(金幣+3): 十分感謝，那就應(yīng)該是沒有連上，后面酶切驗證的時候沒有我目的基因大小的片段！ 2011-04-27 13:23:22
lstt09nk(金幣+3): 很積極，很熱心~~ 2011-04-26 22:55:14
dhmdddd(金幣+3): 十分感謝，那就應(yīng)該是沒有連上，后面酶切驗證的時候沒有我目的基因大小的片段！ 2011-04-27 13:23:22
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首先，如樓上所說，T載體連接依據(jù)的是taq酶能夠在擴增片段的末端加A，而載體的末端被認為加上T，兩者配對連接的。如果你的酶不能在片段末端加A，肯定不能和載體連接。 再次，質(zhì)粒一般是環(huán)形的，提取的質(zhì)粒，線性的幾乎很少。而你在電泳的時候，所用的評判質(zhì)粒大小的是線性的DNA marker，所以用電泳的方式驗證質(zhì)粒是否連接上是不可靠的。判斷質(zhì)粒是否是陽性的一般用PCR結(jié)合雙酶切進行驗證。 第三，質(zhì)粒連接的效率還取決于連接體系中載體和插入片段的摩爾比例。T載體推薦的是載體：DNA=1：2~1:10,我平時一般用1：5左右，基本不會出現(xiàn)連接不上的問題。 希望上述解釋能幫助你。 |
3樓2011-04-26 21:21:16
susizheng
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4樓2011-04-27 10:26:03
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