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小小_木蟲(chóng)木蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
急！互補(bǔ)不回去，應(yīng)該怎么辦？
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| 枯草芽孢桿菌，利用基因同源重組的方法將基因組中的A基因缺失掉，缺失后的性狀比較明顯，抑菌活性明顯下降。但是做互補(bǔ)時(shí)，卻始終都互補(bǔ)不回去：我用的是pHY300PLK質(zhì)粒做載體，連入完整的A基因片段后，電擊轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌菌株中，然后就測(cè)定是否互補(bǔ)回去。不知道我的方法是否有誤？懇請(qǐng)高手指點(diǎn)…… |
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 【分子生物】EPI帖 |
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★
dhd997(金幣+3, EPI+1): good 2011-04-27 13:13:31
dhd997(金幣+3, EPI+1): good 2011-04-27 13:13:31
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首先你要確定你的基因連接沒(méi)有什么問(wèn)題，一定要驗(yàn)證正確。 基因連入重組載體后，基因啟動(dòng)子的方向是不是和載體上強(qiáng)啟動(dòng)子方向一致呢？還有你的基因有沒(méi)有啟動(dòng)子？ 如果不行，就換載體。 可以用誘導(dǎo)劑試試，但是一般過(guò)量表達(dá)載體上的強(qiáng)啟動(dòng)子是不需要誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的，可是有時(shí)并不一定的。。。 還有過(guò)量表達(dá)載體的表達(dá)也需要一定的時(shí)間，可以把時(shí)間延長(zhǎng)一下。 |
2樓2011-04-27 12:31:43
小小_木蟲(chóng)
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，祝工作順利！ 3樓2011-04-27 14:26:56
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★
西瓜(金幣+3): good! 2011-04-28 15:09:06
小小_木蟲(chóng)(金幣+1): 你好，請(qǐng)問(wèn)：如果確認(rèn)沒(méi)有問(wèn)題，那可能是什么呢？謝謝！ 2011-04-28 15:46:28
西瓜(金幣+3): good! 2011-04-28 15:09:06
小小_木蟲(chóng)(金幣+1): 你好，請(qǐng)問(wèn)：如果確認(rèn)沒(méi)有問(wèn)題，那可能是什么呢？謝謝！ 2011-04-28 15:46:28
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1.首先確認(rèn)一下這個(gè)基因外源表達(dá)后，是不是真的表達(dá)了，可以用RT檢測(cè)基因是否轉(zhuǎn)錄，或者用WB檢測(cè)蛋白是否表達(dá)。如果確認(rèn)沒(méi)有問(wèn)題，那可能是： 2.抑菌活性明顯下降，可能不是基因本身確實(shí)引起的，而是在缺失的過(guò)程中，影響的周?chē)幕虻谋磉_(dá)所引起的。 |
4樓2011-04-28 13:55:43
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金幣+5, EPI+1): 理論知識(shí)和實(shí)際經(jīng)驗(yàn)都很強(qiáng)，有前途~ 2011-04-29 23:49:21
西瓜(金幣+5, EPI+1): 理論知識(shí)和實(shí)際經(jīng)驗(yàn)都很強(qiáng)，有前途~ 2011-04-29 23:49:21
| 你先看看這個(gè)基因你缺失的部分，是否和別的基因的編碼區(qū)，轉(zhuǎn)錄起始區(qū)，轉(zhuǎn)錄終止區(qū)有重疊，如果有，就很有可能影響了周?chē)虻谋磉_(dá)；還有和別的基因如果在同一個(gè)操縱子內(nèi)，它的缺失也會(huì)影響周?chē)虻谋磉_(dá)，還有個(gè)問(wèn)題，會(huì)不會(huì)你的基因缺失或者過(guò)表達(dá)之后的表型是一樣的，我實(shí)驗(yàn)室有個(gè)同學(xué)就做了這樣一個(gè)基因，它缺失和大量表達(dá)的變型是一致的，而少量表達(dá)之后可以回復(fù)這個(gè)表型。 |
5樓2011-04-29 22:33:19
yiner
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6樓2017-04-27 10:26:27
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