 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 5 | 1/1 | 返回列表 |
| 查看: 1184 | 回復(fù): 4 | |||
| 本帖產(chǎn)生 1 個(gè) BioEPI ，點(diǎn)擊這里進(jìn)行查看 | |||
| 當(dāng)前只顯示滿足指定條件的回帖，點(diǎn)擊這里查看本話題的所有回帖 | |||
wangdandelia木蟲 (正式寫手)
|
[交流]
引物特異性 已有4人參與
|
||
| 請問PCR過程中，如何提高引物的特異性結(jié)合呢？ |
回復(fù)此樓» 猜你喜歡
一志愿西安交通大學(xué)材料工程專業(yè) 282分求調(diào)劑
已經(jīng)有13人回復(fù)
-
北科281學(xué)碩材料求調(diào)劑
已經(jīng)有6人回復(fù)
-
328求調(diào)劑，英語六級551，有科研經(jīng)歷
已經(jīng)有10人回復(fù)
-
298求調(diào)劑
已經(jīng)有6人回復(fù)
-
310求調(diào)劑
已經(jīng)有4人回復(fù)
-
311求調(diào)劑
已經(jīng)有6人回復(fù)
-
307求調(diào)劑
已經(jīng)有11人回復(fù)
-
材料與化工085600，總分304，本科有兩篇sci參與，求調(diào)劑
已經(jīng)有5人回復(fù)
-
315分，誠求調(diào)劑，材料與化工085600
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
求調(diào)劑一志愿海大，0703化學(xué)學(xué)碩304分，有大創(chuàng)項(xiàng)目，四級已過
已經(jīng)有10人回復(fù)
3樓2011-04-28 16:27:47
xuguanghai
木蟲 (職業(yè)作家)
- BioEPI: 3
- 應(yīng)助: 17 (小學(xué)生)
- 金幣: 2841.2
- 散金: 2764
- 紅花: 16
- 沙發(fā): 42
- 帖子: 3072
- 在線: 296.7小時(shí)
- 蟲號: 449061
- 注冊: 2007-11-02
- 性別: GG
- 專業(yè): 有機(jī)合成
★ ★ ★ ★ ★ ★
小木蟲(金幣+0.5):給個(gè)紅包，謝謝回帖
amisking(金幣+5, EPI+1): 鼓勵(lì)發(fā)帖應(yīng)助。 2011-04-28 19:35:53
小木蟲(金幣+0.5):給個(gè)紅包，謝謝回帖
amisking(金幣+5, EPI+1): 鼓勵(lì)發(fā)帖應(yīng)助。 2011-04-28 19:35:53
|
1、引物設(shè)計(jì) 細(xì)心地進(jìn)行引物設(shè)計(jì)是PCR中最重要的一步。理想的引物對只同目的序列兩側(cè)的單一序列而非其他序列退火。設(shè)計(jì)糟糕的引物可能會同擴(kuò)增其他的非目的序列。下面的指導(dǎo)描述了一個(gè)可以增加特異性的引物所具有的令人滿意的特點(diǎn)： 1.典型的引物18到24個(gè)核苷長。引物需要足夠長，保證序列獨(dú)特性，并降低序列存在于非目的序列位點(diǎn)的可能性。但是長度大于24核苷的引物并不意味著更高的特異性。較長的序列可能會與錯(cuò)誤配對序列雜交，降低了特異性，而且比短序列雜交慢，從而降低了產(chǎn)量。 2.選擇GC含量為40％到60％或GC含量映像模板GC含量的引物。 3.設(shè)計(jì)5'端和中間區(qū)為G或C的引物。這會增加引物的穩(wěn)定性和引物同目的序列雜交的穩(wěn)定性。 4.避免引物對3'末端存在互補(bǔ)序列，這會形成引物二聚體，抑制擴(kuò)增。 5.避免3'末端富含GC。設(shè)計(jì)引物時(shí)保證在最后5個(gè)核苷中含有3個(gè)A或T。 6.避免3'末端的錯(cuò)誤配對。3'端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。 7.避免存在可能會產(chǎn)生內(nèi)部二級結(jié)構(gòu)的序列，這會破壞引物退火穩(wěn)定性。 目的序列上并不存在的附加序列，如限制位點(diǎn)和啟動(dòng)子序列，可以加入到引物5'端而不影響特異性。當(dāng)計(jì)算引物Tm值時(shí)并不包括這些序列，但是應(yīng)該對其進(jìn)行互補(bǔ)性和內(nèi)部二級結(jié)構(gòu)的檢測。 有時(shí)候，對于引物設(shè)計(jì)僅了解有限的序列信息。比如，如果僅知道氨基酸序列，可以設(shè)計(jì)兼并引物。兼并引物是指代表編碼單個(gè)氨基酸所有不同堿基可能性的不同序列的混合物。為了增加特異性，可以參考密碼子使用表，根據(jù)不同生物的堿基使用偏好，減少兼并性。次黃嘌呤可以同所有的堿基配對，降低引物的退火溫度。不要在引物的3'端使用兼并堿基，因?yàn)?'端最后3個(gè)堿基的退火足以在錯(cuò)誤位點(diǎn)起始PCR。使用較高的引物濃度（1%26mu;M到3%26mu;M），因?yàn)樵S多兼并混合物中的引物不是特異性針對目的模板。 2、引物退火溫度 引物的另一個(gè)重要參數(shù)是熔解溫度（Tm）。這是當(dāng)50％的引物和互補(bǔ)序列表現(xiàn)為雙鏈DNA分子時(shí)的溫度。Tm對于設(shè)定PCR退火溫度是必需的。在理想狀態(tài)下，退火溫度足夠低，以保證引物同目的序列有效退火，同時(shí)還要足夠高，以減少非特異性結(jié)合。合理的退火溫度從55℃到70℃。退火溫度一般設(shè)定比引物的Tm低5℃。 設(shè)定Tm有幾種公式。表4列出確定引物Tm最常用的兩種方法。第一個(gè)公式來源于高鹽溶液中的雜交，適用于小于18堿基的引物。第二個(gè)公式根據(jù)GC含量估算Tm。確定引物Tm最可信的方法是近鄰分析法。這種方法從序列一級結(jié)構(gòu)和相鄰堿基的特性預(yù)測引物的雜交穩(wěn)定性。大部分計(jì)算機(jī)程序使用近鄰分析法。 根據(jù)所使用的公式及引物序列的不同，Tm會差異很大。因?yàn)榇蟛糠止教峁┮粋�(gè)估算的Tm值，所有退火溫度只是一個(gè)起始點(diǎn)�？梢酝ㄟ^分析幾個(gè)逐步提高退火溫度的反應(yīng)以提高特異性。開始低于估算的Tm5℃，以2℃為增量，逐步提高退火溫度。較高的退火溫度會減少引物二聚體和非特異性產(chǎn)物的形成。為獲得最佳結(jié)果，兩個(gè)引物應(yīng)具有近似的Tm值。引物對的Tm差異如果超過5℃，就會引物在循環(huán)中使用較低的退火溫度而表現(xiàn)出明顯的錯(cuò)誤起始。如果兩個(gè)引物Tm不同，將退火溫度設(shè)定為比最低的Tm低5℃�；蛘邽榱颂岣咛禺愋�，可以在根據(jù)較高Tm設(shè)計(jì)的退火溫度先進(jìn)行5個(gè)循環(huán)，然后在根據(jù)較低Tm設(shè)計(jì)的退火溫度進(jìn)行剩余的循環(huán)。這使得在較為嚴(yán)緊的條件下可以獲得目的模板的部分拷貝。 3、遞減PCR 遞減PCR通過在PCR的前幾個(gè)循環(huán)使用嚴(yán)緊的退火條件提高特異性。循環(huán)開在比估算的Tm高大約5℃的退火溫度下開始，然后每個(gè)循環(huán)降低1℃到2℃，直到退火溫度低于Tm 5℃。只有同同源性最高的目的模板會被擴(kuò)增。這些產(chǎn)物在隨后的循環(huán)中繼續(xù)擴(kuò)增，并會將擴(kuò)增的非特異性產(chǎn)物排擠出去。遞減PCR對于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法較為有用，如AFLP DNA指紋分析。 4、引物濃度 引物的濃度會影響特異性。最佳的引物濃度一般在0.1到0.5%26mu;M。較高的引物濃度會導(dǎo)致非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增。 為了確定引物濃度，可以在260nm（OD260）測量光密度值。然后使用光吸收值和微摩消光系數(shù)的倒數(shù)（nmol/OD），通過Beers法則（公式1）計(jì)算引物濃度。微摩消光系數(shù)可以使用公式2計(jì)算。與大分子雙鏈DNA可以使用平均消光系數(shù)不同，確定引物的精確濃度必須使用計(jì)算的消光系數(shù)。這是因?yàn)橐镙^短，堿基組成差異很大。在Gibco/BRL定制引物的質(zhì)檢報(bào)告中包含了消光系數(shù)（OD/%26mu;mol）和消光系數(shù)的倒數(shù)（%26mu;mol/OD）。另外，不要使用寡聚核苷酸作為標(biāo)準(zhǔn)，在EB染色的膠上估算引物濃度，因?yàn)橐锖蜆?biāo)準(zhǔn)的染色能力根據(jù)序列不同而差異很大。 http://www.51protocol.com/PCR/RTPCR/20081208/57860.html |
2樓2011-04-28 16:17:11
yabxxh
木蟲 (正式寫手)
- BioEPI: 11
- 應(yīng)助: 22 (小學(xué)生)
- 貴賓: 0.005
- 金幣: 2238
- 散金: 98
- 紅花: 9
- 帖子: 465
- 在線: 88.6小時(shí)
- 蟲號: 157001
- 注冊: 2006-01-05
- 專業(yè): 生物物理、生物化學(xué)與分子
4樓2011-04-28 16:35:34
天使托
專家顧問 (職業(yè)作家)
T.Shen
-
專家經(jīng)驗(yàn): +57 - BioEPI: 17
- 應(yīng)助: 95 (初中生)
- 貴賓: 0.263
- 金幣: 16332.8
- 散金: 593
- 紅花: 74
- 沙發(fā): 9
- 帖子: 3652
- 在線: 289小時(shí)
- 蟲號: 441757
- 注冊: 2007-10-27
- 專業(yè): 微生物生理與生物化學(xué)
- 管轄: 微生物
5樓2011-04-28 16:35:57
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 一志愿西安交通大學(xué)材料工程專業(yè) 282分求調(diào)劑 +11 | 楓橋ZL 2026-03-18 | 13/650 |
|
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 生物學(xué)071000 329分求調(diào)劑 +5 | 我愛生物生物愛?/a> 2026-03-17 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 一志愿中南化學(xué)（0703）總分337求調(diào)劑 +9 | niko- 2026-03-19 | 10/500 |
|
|
|
[考研] 289求調(diào)劑 +7 | 懷瑾握瑜l 2026-03-20 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 能源材料化學(xué)課題組招收碩士研究生8-10名 +5 | 脫穎而出 2026-03-16 | 17/850 |
|
|
|
[考研] 303求調(diào)劑 +5 | 安憶靈 2026-03-22 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 求調(diào)劑 +3 | 13341 2026-03-20 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 0703化學(xué)297求調(diào)劑 +3 | Daisy☆ 2026-03-20 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 313求調(diào)劑 +4 | 肆叁貳壹22 2026-03-19 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 求調(diào)劑 +3 | 白QF 2026-03-21 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 303求調(diào)劑 +5 | 睿08 2026-03-17 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 求調(diào)劑 +3 | Ma_xt 2026-03-17 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 304求調(diào)劑 +7 | 司空. 2026-03-18 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 一志愿西南交通 專碩 材料355 本科雙非 求調(diào)劑 +5 | 西南交通專材355 2026-03-19 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 一志愿吉林大學(xué)材料學(xué)碩321求調(diào)劑 +11 | Ymlll 2026-03-18 | 15/750 |
|
|
|
[考研] 一志愿南理工085701環(huán)境302求調(diào)劑院校 +3 | 葵梓衛(wèi)隊(duì) 2026-03-20 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 281求調(diào)劑（0805） +14 | 煙汐憶海 2026-03-16 | 25/1250 |
|
|
|
[考研] 材料與化工求調(diào)劑 +7 | 為學(xué)666 2026-03-16 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 308求調(diào)劑 +4 | 是Lupa啊 2026-03-16 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 333求調(diào)劑 +3 | 文思客 2026-03-16 | 7/350 |
|