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5樓2011-04-28 16:35:57
xuguanghai
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1、引物設(shè)計(jì) 細(xì)心地進(jìn)行引物設(shè)計(jì)是PCR中最重要的一步。理想的引物對(duì)只同目的序列兩側(cè)的單一序列而非其他序列退火。設(shè)計(jì)糟糕的引物可能會(huì)同擴(kuò)增其他的非目的序列。下面的指導(dǎo)描述了一個(gè)可以增加特異性的引物所具有的令人滿(mǎn)意的特點(diǎn)： 1.典型的引物18到24個(gè)核苷長(zhǎng)。引物需要足夠長(zhǎng)，保證序列獨(dú)特性，并降低序列存在于非目的序列位點(diǎn)的可能性。但是長(zhǎng)度大于24核苷的引物并不意味著更高的特異性。較長(zhǎng)的序列可能會(huì)與錯(cuò)誤配對(duì)序列雜交，降低了特異性，而且比短序列雜交慢，從而降低了產(chǎn)量。 2.選擇GC含量為40％到60％或GC含量映像模板GC含量的引物。 3.設(shè)計(jì)5'端和中間區(qū)為G或C的引物。這會(huì)增加引物的穩(wěn)定性和引物同目的序列雜交的穩(wěn)定性。 4.避免引物對(duì)3'末端存在互補(bǔ)序列，這會(huì)形成引物二聚體，抑制擴(kuò)增。 5.避免3'末端富含GC。設(shè)計(jì)引物時(shí)保證在最后5個(gè)核苷中含有3個(gè)A或T。 6.避免3'末端的錯(cuò)誤配對(duì)。3'端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。 7.避免存在可能會(huì)產(chǎn)生內(nèi)部二級(jí)結(jié)構(gòu)的序列，這會(huì)破壞引物退火穩(wěn)定性。 目的序列上并不存在的附加序列，如限制位點(diǎn)和啟動(dòng)子序列，可以加入到引物5'端而不影響特異性。當(dāng)計(jì)算引物Tm值時(shí)并不包括這些序列，但是應(yīng)該對(duì)其進(jìn)行互補(bǔ)性和內(nèi)部二級(jí)結(jié)構(gòu)的檢測(cè)。 有時(shí)候，對(duì)于引物設(shè)計(jì)僅了解有限的序列信息。比如，如果僅知道氨基酸序列，可以設(shè)計(jì)兼并引物。兼并引物是指代表編碼單個(gè)氨基酸所有不同堿基可能性的不同序列的混合物。為了增加特異性，可以參考密碼子使用表，根據(jù)不同生物的堿基使用偏好，減少兼并性。次黃嘌呤可以同所有的堿基配對(duì)，降低引物的退火溫度。不要在引物的3'端使用兼并堿基，因?yàn)?'端最后3個(gè)堿基的退火足以在錯(cuò)誤位點(diǎn)起始PCR。使用較高的引物濃度（1%26mu;M到3%26mu;M），因?yàn)樵S多兼并混合物中的引物不是特異性針對(duì)目的模板。 2、引物退火溫度 引物的另一個(gè)重要參數(shù)是熔解溫度（Tm）。這是當(dāng)50％的引物和互補(bǔ)序列表現(xiàn)為雙鏈DNA分子時(shí)的溫度。Tm對(duì)于設(shè)定PCR退火溫度是必需的。在理想狀態(tài)下，退火溫度足夠低，以保證引物同目的序列有效退火，同時(shí)還要足夠高，以減少非特異性結(jié)合。合理的退火溫度從55℃到70℃。退火溫度一般設(shè)定比引物的Tm低5℃。 設(shè)定Tm有幾種公式。表4列出確定引物Tm最常用的兩種方法。第一個(gè)公式來(lái)源于高鹽溶液中的雜交，適用于小于18堿基的引物。第二個(gè)公式根據(jù)GC含量估算Tm。確定引物Tm最可信的方法是近鄰分析法。這種方法從序列一級(jí)結(jié)構(gòu)和相鄰堿基的特性預(yù)測(cè)引物的雜交穩(wěn)定性。大部分計(jì)算機(jī)程序使用近鄰分析法。 根據(jù)所使用的公式及引物序列的不同，Tm會(huì)差異很大。因?yàn)榇蟛糠止教峁┮粋�(gè)估算的Tm值，所有退火溫度只是一個(gè)起始點(diǎn)。可以通過(guò)分析幾個(gè)逐步提高退火溫度的反應(yīng)以提高特異性。開(kāi)始低于估算的Tm5℃，以2℃為增量，逐步提高退火溫度。較高的退火溫度會(huì)減少引物二聚體和非特異性產(chǎn)物的形成。為獲得最佳結(jié)果，兩個(gè)引物應(yīng)具有近似的Tm值。引物對(duì)的Tm差異如果超過(guò)5℃，就會(huì)引物在循環(huán)中使用較低的退火溫度而表現(xiàn)出明顯的錯(cuò)誤起始。如果兩個(gè)引物Tm不同，將退火溫度設(shè)定為比最低的Tm低5℃�；蛘邽榱颂岣咛禺愋裕梢栽诟鶕�(jù)較高Tm設(shè)計(jì)的退火溫度先進(jìn)行5個(gè)循環(huán)，然后在根據(jù)較低Tm設(shè)計(jì)的退火溫度進(jìn)行剩余的循環(huán)。這使得在較為嚴(yán)緊的條件下可以獲得目的模板的部分拷貝。 3、遞減PCR 遞減PCR通過(guò)在PCR的前幾個(gè)循環(huán)使用嚴(yán)緊的退火條件提高特異性。循環(huán)開(kāi)在比估算的Tm高大約5℃的退火溫度下開(kāi)始，然后每個(gè)循環(huán)降低1℃到2℃，直到退火溫度低于Tm 5℃。只有同同源性最高的目的模板會(huì)被擴(kuò)增。這些產(chǎn)物在隨后的循環(huán)中繼續(xù)擴(kuò)增，并會(huì)將擴(kuò)增的非特異性產(chǎn)物排擠出去。遞減PCR對(duì)于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法較為有用，如AFLP DNA指紋分析。 4、引物濃度 引物的濃度會(huì)影響特異性。最佳的引物濃度一般在0.1到0.5%26mu;M。較高的引物濃度會(huì)導(dǎo)致非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增。 為了確定引物濃度，可以在260nm（OD260）測(cè)量光密度值。然后使用光吸收值和微摩消光系數(shù)的倒數(shù)（nmol/OD），通過(guò)Beers法則（公式1）計(jì)算引物濃度。微摩消光系數(shù)可以使用公式2計(jì)算。與大分子雙鏈DNA可以使用平均消光系數(shù)不同，確定引物的精確濃度必須使用計(jì)算的消光系數(shù)。這是因?yàn)橐镙^短，堿基組成差異很大。在Gibco/BRL定制引物的質(zhì)檢報(bào)告中包含了消光系數(shù)（OD/%26mu;mol）和消光系數(shù)的倒數(shù)（%26mu;mol/OD）。另外，不要使用寡聚核苷酸作為標(biāo)準(zhǔn)，在EB染色的膠上估算引物濃度，因?yàn)橐锖蜆?biāo)準(zhǔn)的染色能力根據(jù)序列不同而差異很大。 http://www.51protocol.com/PCR/RTPCR/20081208/57860.html |
2樓2011-04-28 16:17:11
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3樓2011-04-28 16:27:47
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