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[交流]
請教重組質(zhì)粒快檢的具體方法以及原理。。。。
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昨日看見某帖子說關于驗證重組載體，樓下有位朋友說用快檢的方法可以迅速檢測出來。。。 這是該朋友的回帖的原內(nèi)容： 快檢就是直接用搖起的菌液取100uL，加50uL的苯酚和50uL的氯仿渦旋離心， 取上清跑膠，對照上個空載體，就是沒有連片段前的質(zhì)粒（環(huán)合的哈）， 或者和你載體差不多大小的質(zhì)粒也可，一般連進去的重組質(zhì)粒會跑得慢點， 憑這個就能鑒定哪些連進去了，然后再提質(zhì)粒酶切就好了 因為我們實驗室就是一般的PCR，酶切質(zhì)粒來驗證，快檢沒有做過，所以我想問問大家具體的方法是什么？原理又是怎樣？謝謝了！ 苯酚和氯仿的作用是什么呢？ 謝謝了。。。。。 |
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 分子生化實驗經(jīng)驗積累 | 【分子生物】EPI帖 |
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小木蟲(金幣+0.5):給個紅包，謝謝回帖
dhd997(金幣+5): 歡迎交流 2011-04-30 09:16:49
天使托(金幣+1): 2011-05-13 12:30:31
小木蟲(金幣+0.5):給個紅包，謝謝回帖
dhd997(金幣+5): 歡迎交流 2011-04-30 09:16:49
天使托(金幣+1): 2011-05-13 12:30:31
| 我們實驗室也在用這個方法，PCR驗證假陽性率比較高，如果挑的轉(zhuǎn)化子比較多，提質(zhì)粒不僅費時費力，還浪費試劑盒。實驗室一個師兄按照分子生物學手冊上的配方配了一個快速裂解液，好像有甘油，溴酚藍，SDS之類的。轉(zhuǎn)化子長好后，取1ml菌液，離心棄上清，加入50μl上述裂解液，重懸后37℃保溫半小時，之后離心，上清直接上樣就可以了，一定記得加marker和空載體。在電泳圖上你可以同時看到RNA（如果沒加RNAase的話），質(zhì)粒，基因組。這個方法快速，簡單，便宜，大家可以嘗試一下。 |
10樓2011-04-30 08:57:13
★ ★ ★ ★ ★ ★
小木蟲(金幣+0.5):給個紅包，謝謝回帖
西瓜(金幣+5, EPI+1): 感謝分享！我們實驗室沒有用特殊的緩沖液，就苯酚氯仿，用得一直也不錯呢。 2011-05-16 16:43:37
小木蟲(金幣+0.5):給個紅包，謝謝回帖
西瓜(金幣+5, EPI+1): 感謝分享！我們實驗室沒有用特殊的緩沖液，就苯酚氯仿，用得一直也不錯呢。 2011-05-16 16:43:37
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不好意思，我今天才看到你的回復�？焖倭呀庖旱呐浞剑� 50mmol/L Tris-HCl （pH6.8） 1% SDS 2mmol/L EDTA 400mmol/L 蔗糖 0.01% 溴酚藍 如果在使用過程中發(fā)現(xiàn)細胞裂解太嚴重，就是離心取上清時發(fā)現(xiàn)蛋白沉淀黏黏糊糊那就把SDS的量降低點。你可以先把其他的藥品配好，取出一部分來加入不同的SDS試一試，我配過兩次有一次比較好用，另外一次就發(fā)現(xiàn)SDS可能太多了，可能不同公司的SDS質(zhì)量也不太一樣造成的吧。 |
12樓2011-05-16 10:38:16
3樓2011-04-29 11:08:43
4樓2011-04-29 11:09:35
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8樓2011-04-29 11:54:29
xiaoweiwei121
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9樓2011-04-30 04:56:01
11樓2011-05-04 14:37:39
13樓2011-05-16 11:24:39
★
小木蟲(金幣+0.5):給個紅包，謝謝回帖
小木蟲(金幣+0.5):給個紅包，謝謝回帖
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本帖內(nèi)容被屏蔽 |
14樓2011-05-16 15:06:07
15樓2013-03-22 10:10:46
16樓2013-10-25 00:00:24
簡單回復
zyxme2樓
2011-04-29 11:04
回復
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