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酶切條件
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最近要開始做酶切了，在研究反應(yīng)條件，檢索文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，不同實(shí)驗(yàn)中同一種內(nèi)切酶的孵育時(shí)間竟然還不相同，有說過夜的，有的就2,3個(gè)小時(shí)的，差別還挺大。另外，有說PCR產(chǎn)物要先回收的，而實(shí)際上也有直接切下去，很好奇這個(gè)反應(yīng)條件該怎么定下來~~~ |
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2樓2011-05-12 23:07:31
冼亮淀粉酶
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xwsooo(金幣+1): 2011-05-13 07:49:49
dhd997(金幣+5): 很對(duì) 2011-05-13 09:15:17
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你切多久能切好就切多久，別人的只能參考，而且你不同的樣品用同一種酶來切不一定切多久就能切好。就是同樣的材料，不同的時(shí)候提取的純度也不同，酶切時(shí)間也不同，就像我有一個(gè)質(zhì)粒，某次提取的一切就好，另一次提取的老是切不完全。 PCR產(chǎn)物也是，別人的產(chǎn)物或許沒有一點(diǎn)兒雜帶，而你的就不一定了，人家不回收就切是因?yàn)橹滥茏龊�，而你自己的還不知道呢，別光看別人怎么做，別人的不一定適合自己。 |
3樓2011-05-13 01:50:06
cdl007
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酶切條件的說，說明書上1個(gè)小時(shí)就能切開。。。 但是在加保護(hù)堿基的時(shí)候有個(gè)表不知道你注意了沒有 http://lvxh.bokee.com/3953618.html 可以參考一下 有的酶是2個(gè)小時(shí)效率就不錯(cuò)，但是有的要20小時(shí)才達(dá)到90% 所以保守一點(diǎn)的話，俺們基本都是過夜切的 時(shí)間太長也不好，怕切除星號(hào)活性 切得時(shí)候，更深一點(diǎn)的話，要考慮目標(biāo)序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)。，所以切長點(diǎn)時(shí)間是首選 不過你可以切完了泡個(gè)電泳看看，多長時(shí)間能切開一目了然 |
4樓2011-05-13 05:24:30
雪山飛狐7233
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dhd997(金幣+2): 如果把你的問題匯總一下，發(fā)個(gè)資源帖，也可以幫助大家啊 2011-05-13 09:16:11
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俺那個(gè)說明書木有寫參考反應(yīng)體系。。但有這樣一些文字： 16-hour incubationg:a 50 ul reaction containing 1 ug of DNA and 50 units of enzyme incubated for 16 hours results in the same pattern of DNAbands as a reaction incubated for 1 hour with 1 unit of enzyme. survival in a reaction :a minimum of 0.13 unit is required to digest 1 ug of substrate DNA in 16 hours 是不是可以參照這些設(shè)計(jì)體系？ |
9樓2011-05-13 08:02:19
shaquila
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10樓2011-05-13 10:16:54
bbwalkman
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11樓2011-05-13 10:22:09
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xwsooo(金幣+2): 非常感謝 2011-05-13 15:17:05
dhd997(金幣+5): 鼓勵(lì)交流 2011-05-13 15:21:46
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不同內(nèi)切酶，不同公司產(chǎn)品都有所不同，如果做雙酶切最好選用同一家公司的，因?yàn)橥还緯?huì)為雙酶切準(zhǔn)備公用buffer。各種離子濃度時(shí)影響酶切效率的關(guān)鍵之一。至于酶切時(shí)間，都是不同的，每個(gè)公司以及不同的沒都有區(qū)別，你可以仔細(xì)看他們的產(chǎn)品說明書，一般是比較大的一本書上，上面都有，上面還有好多注意事項(xiàng)和例子什么的，講的很詳細(xì)。酶切時(shí)間和酶的加入量要根據(jù)具體情況調(diào)配。單酶切和雙酶切即使酶相同，也是有區(qū)別的，因?yàn)殡p酶切換用了公用buffer，降低酶的效率，所以有時(shí)候要加大個(gè)別酶的加入量或延長反應(yīng)時(shí)間，才能完全酶切好。至于是否需要回收，這個(gè)回答是肯定的，最好回收，要么就純化。因?yàn)镻CR的Buffer與內(nèi)切酶是不一樣的，即使成分一樣，含量也有差別，肯定會(huì)有影響的，有些人不回收也做出來了，那是運(yùn)氣好，正好那酶的Buffer跟PCR的相似或那酶對(duì)Buffer要求不高。但要是沒切出來，那就要注意一下了。祝你實(shí)驗(yàn)順利！ |
12樓2011-05-13 10:36:25
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嗯，是有說明書，上面說了孵育溫度，但沒有寫酶切時(shí)間啊，只有這樣一些文字： 16-hour incubationg:a 50 ul reaction containing 1 ug of DNA and 50 units of enzyme incubated for 16 hours results in the same pattern of DNAbands as a reaction incubated for 1 hour with 1 unit of enzyme. survival in a reaction :a minimum of 0.13 unit is required to digest 1 ug of substrate DNA in 16 hours 是不是可以參照這些設(shè)計(jì)體系？ |
13樓2011-05-13 10:36:40
14樓2011-05-13 10:38:51
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