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ssl225新蟲(chóng) (初入文壇)
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求助質(zhì)粒大提配方（自己配試劑）或哪家的質(zhì)粒大提試劑盒更好 已有1人參與
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brightfuture01
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2樓2011-05-16 13:14:09
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ssl225
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【答案】應(yīng)助回帖
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告訴你自己配置大量提取質(zhì)粒的方法：（推薦以及參考） 首先是溶液的配制： （I）：Solution I : 組分濃度 ：25mM Tris-Hcl (pH8.0），10mM EDTA， 50mM Glucose: 配制量：1 L 1M Tris-Hcl (pH8.0） 25ml 0.5M EDTA(pH8.0） 20ml 20% Glucose（1.11M）45ml dH2O 910ml 高溫高壓滅菌后4℃保存 ，使用前每50ml的Solution I中加入2ml的RNase A(20mg/ml) （II）Solution II:組分濃度 ：200mM NaOH,1%(W/V)SDS 配置量 500ml 10%SDS 50ml 2M NaOH 50ml 加滅菌水定容至500ml 充分混勻，室溫保存（時(shí)間最好不要超過(guò)1個(gè)月） SDS容易產(chǎn)生氣泡，不要?jiǎng)×覕嚢琛?br /> （III）Solution III:組分濃度：3M KOAc，5M CH3COOH 配制量：500ml KOAc 147g CH3COOH 57.5ml 加入300ml去離子水?dāng)嚢枞芙�，加去離子水定容至500ml 高溫高壓滅菌后4℃保存。 根據(jù)自己需要的量等比例縮小配置量（Solution I,Solution II and Solution III） 質(zhì)粒DNA的提取 (1) 用無(wú)菌接種環(huán)在平板上挑取單菌落，接種到5mlLB液體培養(yǎng)基（含 100ug/ml Amp），37℃ 220rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。 (2) 取1.5mL培養(yǎng)液倒入1.5mLeppendorf管中，12000rpm離心1min。 棄盡上清，使液體流盡。 (3) 加入預(yù)冷的溶液Ⅰ100uL，漩渦振蕩，懸浮菌體沉淀，冰浴5min。 (4) 加入新配制的溶液Ⅱ200uL，立即將離心管緩緩顛倒數(shù)次直到溶液變清亮，冰浴5min。 (5) 加入預(yù)冷的溶液Ⅲ150uL，溫和混勻，冰浴5min。12000rpm離心10 min。 (6) 將上清移入干凈的1.5 mL dorf 管中，加入等體積（約450ul）酚/氯仿（1：1），上下顛倒混勻，12000rpm離心5min。 (7) 將上層水相移入干凈的1.5 mL eppendorf 離心管中，加入2.5倍體積（約 1mL）預(yù)冷的無(wú)水乙醇，上下顛倒混勻后，置－20℃冰箱中20 min。 (8) 室溫12000rpm離心10 min。 (9) 徹底去上清，沿管壁加1mL 70%乙醇漂洗沉淀，立即倒去上清，自然干燥。 (10) 將沉淀溶于40uL TE（含10ug/mL的RNase A）中，37℃保溫30 min。 (11) 用1.0%瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)提取情況，余下質(zhì)粒于-20℃保存?zhèn)?br /> 用。 根據(jù)你的需要，按比例提取大體積的菌液質(zhì)粒，有5ml或是10ml或是50ml的離心管的話先離心均液，然后按體積的比例加試劑即可。應(yīng)該很方便，離心時(shí)間可以減少至5min也可以，第（7）步放入－20℃冰箱中20 min可以減少至10min，總體時(shí)間大概在1h以內(nèi)吧~  |
6樓2011-05-16 18:52:02
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告訴你自己配置大量提取質(zhì)粒的方法：（推薦以及參考） 首先是溶液的配制： （I）：Solution I : 組分濃度 ：25mM Tris-Hcl (pH8.0），10mM EDTA， 50mM Glucose: 配制量：1 L 1M Tris-Hcl (pH8.0） 25ml 0.5M EDTA(pH8.0） 20ml 20% Glucose（1.11M）45ml dH2O 910ml 高溫高壓滅菌后4℃保存 ，使用前每50ml的Solution I中加入2ml的RNase A(20mg/ml) （II）Solution II:組分濃度 ：200mM NaOH,1%(W/V)SDS 配置量 500ml 10%SDS 50ml 2M NaOH 50ml 加滅菌水定容至500ml 充分混勻，室溫保存（時(shí)間最好不要超過(guò)1個(gè)月） SDS容易產(chǎn)生氣泡，不要?jiǎng)×覕嚢琛?br /> （III）Solution III:組分濃度：3M KOAc，5M CH3COOH 配制量：500ml KOAc 147g CH3COOH 57.5ml 加入300ml去離子水?dāng)嚢枞芙�，加去離子水定容至500ml 高溫高壓滅菌后4℃保存。 根據(jù)自己需要的量等比例縮小配置量（Solution I,Solution II and Solution III） 質(zhì)粒DNA的提取 (1) 用無(wú)菌接種環(huán)在平板上挑取單菌落，接種到5mlLB液體培養(yǎng)基（含 100ug/ml Amp），37℃ 220rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。 (2) 取1.5mL培養(yǎng)液倒入1.5mLeppendorf管中，12000rpm離心1min。 棄盡上清，使液體流盡。 (3) 加入預(yù)冷的溶液Ⅰ100uL，漩渦振蕩，懸浮菌體沉淀，冰浴5min。 (4) 加入新配制的溶液Ⅱ200uL，立即將離心管緩緩顛倒數(shù)次直到溶液變清亮，冰浴5min。 (5) 加入預(yù)冷的溶液Ⅲ150uL，溫和混勻，冰浴5min。12000rpm離心10 min。 (6) 將上清移入干凈的1.5 mL dorf 管中，加入等體積（約450ul）酚/氯仿（1：1），上下顛倒混勻，12000rpm離心5min。 (7) 將上層水相移入干凈的1.5 mL eppendorf 離心管中，加入2.5倍體積（約 1mL）預(yù)冷的無(wú)水乙醇，上下顛倒混勻后，置－20℃冰箱中20 min。 (8) 室溫12000rpm離心10 min。 (9) 徹底去上清，沿管壁加1mL 70%乙醇漂洗沉淀，立即倒去上清，自然干燥。 (10) 將沉淀溶于40uL TE（含10ug/mL的RNase A）中，37℃保溫30 min。 (11) 用1.0%瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)提取情況，余下質(zhì)粒于-20℃保存?zhèn)?br /> 用。 根據(jù)你的需要，按比例提取大體積的菌液質(zhì)粒，有5ml或是10ml或是50ml的離心管的話先離心菌液收集菌體，然后按體積的比例加試劑即可。應(yīng)該很方便，離心時(shí)間可以減少至5min也可以，第（7）步放入－20℃冰箱中20 min可以減少至10min，總體時(shí)間大概在1h以內(nèi)吧~ |
7樓2011-05-16 18:54:20
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