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lihongyeer金蟲 (正式寫手)
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[求助]
DNA測(cè)序求助
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想通過16s rDNA來對(duì)微生物進(jìn)行鑒定，但測(cè)序公司回復(fù)說：“您的樣品（12株）的1492R向 的測(cè)序結(jié)果出現(xiàn)了重疊峰，測(cè)序失敗，這有可能是您的模板存在污染，或是由于引物與模板的結(jié)合性不單一，導(dǎo)致擴(kuò)增過程中有大小相近的非特異性條帶雜片段產(chǎn)生，而瓊脂糖回收無法分離這樣的片段所致，建議您改進(jìn)實(shí)驗(yàn)條件重新提供樣品” 菌株我是通過四輪分離純化的，應(yīng)該不會(huì)全部污染，引物我用的是通用引物1492r和27f，DNA提取使用的天根生化的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，請(qǐng)問各位有經(jīng)驗(yàn)的蟲友，現(xiàn)在該怎么做？ |
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lxj341401
至尊木蟲 (著名寫手)
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2樓2011-05-18 18:42:53
lihongyeer
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3樓2011-05-18 21:18:29
xp198766
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4樓2011-05-18 21:53:12
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5樓2011-05-23 00:00:06
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【答案】應(yīng)助回帖
lihongyeer(金幣+20): 多謝多謝！ 2011-05-23 15:38:38
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（1）換家公司，重新做PCR，回收后，送別家測(cè)序公司。公司測(cè)序，特別是PCR產(chǎn)物直接測(cè)序，經(jīng)常會(huì)搞錯(cuò)的。不一定是他說的什么產(chǎn)物污染，出現(xiàn)大小相同的片段，跟測(cè)序手法也有關(guān)系的。出現(xiàn)大小相同的片段的概率很小的！或者在送這個(gè)公司，他可能會(huì)給你不同結(jié)果。 （2）連接T載體，現(xiàn)在T載體連接很好做的，好多公司出的簡(jiǎn)便的T載體，幾個(gè)小時(shí)就連好，過夜后，篩斑，很快很簡(jiǎn)單。但是如果真的出現(xiàn)小相同的片段，那一定要挑取單菌落，這個(gè)很重要，而且最好多挑幾個(gè)克隆，送測(cè)序。 （3）把自己的菌株在純化，在活化，細(xì)菌DNA可以不用提取，直接加在PCR反應(yīng)體系里就行，不用什么試劑盒，浪費(fèi)。 （4）換其他16srDNA引物，這個(gè)文獻(xiàn)里有，不難搞。 （先按第一條去弄，不行了，在弄下面的，很有可能就是公司沒搞定，給你找借口呢，不用擔(dān)心，不難搞） 祝你實(shí)驗(yàn)順利��！ |
6樓2011-05-23 09:21:51
7樓2015-07-07 09:40:50
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