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lihongyeer金蟲 (正式寫手)
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[求助]
DNA測序求助
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想通過16s rDNA來對微生物進行鑒定，但測序公司回復(fù)說：“您的樣品（12株）的1492R向 的測序結(jié)果出現(xiàn)了重疊峰，測序失敗，這有可能是您的模板存在污染，或是由于引物與模板的結(jié)合性不單一，導(dǎo)致擴增過程中有大小相近的非特異性條帶雜片段產(chǎn)生，而瓊脂糖回收無法分離這樣的片段所致，建議您改進實驗條件重新提供樣品” 菌株我是通過四輪分離純化的，應(yīng)該不會全部污染，引物我用的是通用引物1492r和27f，DNA提取使用的天根生化的細菌基因組DNA提取試劑盒，請問各位有經(jīng)驗的蟲友，現(xiàn)在該怎么做？ |
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lxj341401
至尊木蟲 (著名寫手)
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2樓2011-05-18 18:42:53
lihongyeer
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3樓2011-05-18 21:18:29
xp198766
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5樓2011-05-23 00:00:06
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【答案】應(yīng)助回帖
lihongyeer(金幣+20): 多謝多謝！ 2011-05-23 15:38:38
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（1）換家公司，重新做PCR，回收后，送別家測序公司。公司測序，特別是PCR產(chǎn)物直接測序，經(jīng)常會搞錯的。不一定是他說的什么產(chǎn)物污染，出現(xiàn)大小相同的片段，跟測序手法也有關(guān)系的。出現(xiàn)大小相同的片段的概率很小的！或者在送這個公司，他可能會給你不同結(jié)果。 （2）連接T載體，現(xiàn)在T載體連接很好做的，好多公司出的簡便的T載體，幾個小時就連好，過夜后，篩斑，很快很簡單。但是如果真的出現(xiàn)小相同的片段，那一定要挑取單菌落，這個很重要，而且最好多挑幾個克隆，送測序。 （3）把自己的菌株在純化，在活化，細菌DNA可以不用提取，直接加在PCR反應(yīng)體系里就行，不用什么試劑盒，浪費。 （4）換其他16srDNA引物，這個文獻里有，不難搞。 （先按第一條去弄，不行了，在弄下面的，很有可能就是公司沒搞定，給你找借口呢，不用擔心，不難搞） 祝你實驗順利�。� |
6樓2011-05-23 09:21:51
7樓2015-07-07 09:40:50
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