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seamuse木蟲 (著名寫手)
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[求助]
轉(zhuǎn)基因植株DNA PCR檢測要不就不出帶，要不就連水和陰性對照都出帶？？？急急急�。�！
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我最近在檢測轉(zhuǎn)基因植株T1和T4代DNA,用CTAB法小提的，DNA原液的濃度是3000ng/ul左右，（見附件）稀釋20倍后取2微升做的模板，引物1（有師姐已經(jīng)用過了，效果還挺好的）擴(kuò)增的片段大小在950bp左右，25微升體系如下 buffer 2.5， dntp 2, 引物各1微升， taq酶（5U）0.2微升 模板 2 微升 水 16.3 擴(kuò)增程序如下95 5min ,94 50s,56 40s,72 90s,35循環(huán)，72,10min. 但是擴(kuò)增結(jié)果總是不好，開始是只有很少的幾個(gè)樣出帶，（應(yīng)該大部分都是陽性植株才對，因?yàn)樯弦淮际菣z測過的，）其中也包括陽性的質(zhì)粒對照，見圖1， 我以為是引物合成不好，就重新合成了但是結(jié)果還是不好，后來又設(shè)計(jì)了幾對引物但結(jié)果還是不好，要不就是連水和轉(zhuǎn)基因母本（陰性對照）都出帶，要不就是還是和之前一樣都不出帶，從第2張圖開始就是另外的引物跑的了，只要出帶的都在目的帶的大小左右 圖1 圖2 圖3也是同樣的情況，水和陰性對照（bfck）都出帶了 圖4pcr，有類似于彌散的現(xiàn)象，還有的就是最下面很亮類似于引物二聚體，像彗星似的帶，這張的圖放反了，MAKER也表示反了 圖5，前面的都有帶，但很模糊，后面的都沒有了而且拖尾現(xiàn)象嚴(yán)重， [ Last edited by seamuse on 2011-5-18 at 18:14 ] |
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9樓2011-05-24 15:41:50
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dhd997(金幣+5): good 2011-05-19 12:46:11
seamuse(金幣+5): 非常感謝你的建議��！ 2011-05-19 13:12:05
dhd997(金幣+5): good 2011-05-19 12:46:11
seamuse(金幣+5): 非常感謝你的建議��！ 2011-05-19 13:12:05
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首先排除模板污染，另外就是避免上樣過程中樣品漂移。只用雙蒸水做一次P，看結(jié)果如何； 再找一些未轉(zhuǎn)基因的樣品，進(jìn)行PCR，避免基因組出現(xiàn)錯(cuò)配導(dǎo)致的假陽性； 不出帶的和彌散的，估計(jì)是引物的問題。可以考慮調(diào)整一下退火溫度，檢查一下引物的匹配度。 我能想到的就這些，祝樓主好運(yùn)~！ |
3樓2011-05-19 09:19:15
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4樓2011-05-19 18:39:15
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