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[交流] 合成一段DNA的問(wèn)題？引物，PCR

想合成一段雙鏈的DNA，大概50個(gè)BP，好像公司合的話價(jià)格稍高。
想設(shè)計(jì)成兩段引物，想問(wèn)下如果是兩段互補(bǔ)DNA雙鏈的話可以利用一定條件直接使其結(jié)合成雙鏈嗎？或是設(shè)計(jì)成兩段有重疊的引物，互為模板，是否可行呢？條件大概怎么控制？

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1樓 2012-02-11 11:55:13

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joan198108

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重疊延伸應(yīng)該可行吧

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2樓2012-02-11 12:13:55

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wanhscn

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運(yùn)氣好的話，理論上可行！
運(yùn)氣不好，還是得不到你想要的。

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3樓2012-02-11 13:08:15

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樓: Originally posted by joan198108 at 2012-02-11 12:13:55:
重疊延伸應(yīng)該可行吧

重疊延伸就是兩段引物重疊相互P吧，可是這樣做的話很難找到合適的Tm值啊，如果重疊過(guò)長(zhǎng)Tm太高怎么P ？段的話又怕P不出來(lái)。。。。。

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4樓2012-02-11 13:29:57

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blackrose8089

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loveskyzhou(金幣+1): 2012-02-13 17:46:40

可以合成兩段寡核苷酸單鏈（加上酶切位點(diǎn)），加上退火緩沖液后從94度降溫到退火溫度，連到載體上轉(zhuǎn)化大腸桿菌，測(cè)序驗(yàn)證，可以引入新的酶切位點(diǎn)等。

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5樓2012-02-11 13:33:32

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joan198108

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4樓: Originally posted by loveskyzhou at 2012-02-11 13:29:57:
重疊延伸就是兩段引物重疊相互P吧，可是這樣做的話很難找到合適的Tm值啊，如果重疊過(guò)長(zhǎng)Tm太高怎么P ？段的話又怕P不出來(lái)。。。。。

總廠才50bp，我有同學(xué)合成過(guò)70bp的引物，據(jù)說(shuō)最后目的條帶擴(kuò)增成功，所以重疊可以適當(dāng)?shù)拈L(zhǎng)一些。關(guān)鍵是PCR后的目的條帶比較短，所以電泳分離就比較麻煩，如何保證最終的產(chǎn)物都是延伸完全的，這是個(gè)問(wèn)題。

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6樓2012-02-11 13:51:02

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fwks3518

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50bp，比引物長(zhǎng)不了多少，那干脆按照引物合成算了，合成正反兩條鏈，一攙和就雙鏈了^_^

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7樓2012-02-11 15:19:02

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AnaSequence

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5樓: Originally posted by blackrose8089 at 2012-02-11 13:33:32:
可以合成兩段寡核苷酸單鏈（加上酶切位點(diǎn)），加上退火緩沖液后從94度降溫到退火溫度，連到載體上轉(zhuǎn)化大腸桿菌，測(cè)序驗(yàn)證，可以引入新的酶切位點(diǎn)等。

有些錢(qián)不能省的。至少要像這個(gè)專(zhuān)家說(shuō)的做。小片段最好不要再做延伸了，直接合成兩條鏈變性退火形成酶切位點(diǎn)的，退火后就連接吧。再加入其它對(duì)連接而言是雜質(zhì)的試劑就要純化，小片段很不好純化的。

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8樓2012-02-11 20:52:48

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lizhaoge

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應(yīng)該可行！PCR條件要跟堿基數(shù)目和種類(lèi)來(lái)定，可以在通過(guò)軟件確定

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9樓2012-02-11 22:08:24

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fooooooooox

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合成兩條30nt 單鏈，中間約10nt互補(bǔ).加pcr酶，只用一個(gè)循環(huán)，延伸時(shí)間10分鐘。要純的話，可以3%膠回收。一般純的話，用乙醇沉淀就可以了。

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10樓2012-02-12 00:07:19

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空谷幽風(fēng)

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loveskyzhou(金幣+1): 2012-02-13 17:44:50

告訴你公司對(duì)這種小片段是怎么合成的：由于你要的DNA只有50bp，他們會(huì)先把這兩條鏈分別合成（就當(dāng)是合了兩條50nt的引物，這個(gè)對(duì)于目前的技術(shù)非常容易實(shí)現(xiàn)），然后用這兩條引物做個(gè)退火就OK了。這樣得到的雙鏈可以直接用來(lái)做連接或者PCR的模板

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11樓2012-02-12 09:26:16

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loveskyzhou

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樓: Originally posted by blackrose8089 at 2012-02-11 13:33:32:
可以合成兩段寡核苷酸單鏈（加上酶切位點(diǎn)），加上退火緩沖液后從94度降溫到退火溫度，連到載體上轉(zhuǎn)化大腸桿菌，測(cè)序驗(yàn)證，可以引入新的酶切位點(diǎn)等。

是馬上退到退火溫度還是慢慢降溫呢？

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12樓2012-02-13 17:47:09

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12樓: Originally posted by loveskyzhou at 2012-02-13 17:47:09:
是馬上退到退火溫度還是慢慢降溫呢？

可以用水浴鍋，將溫度升到94度后，光掉電源，讓她慢慢降。。

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13樓2012-02-13 18:45:57

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我說(shuō)啊，就別那么折騰了，現(xiàn)有的基因合成技術(shù)很成熟價(jià)格也不高，那么點(diǎn)片段500大洋搞定了，何必去搞那些呢，就算你引物設(shè)計(jì)好啦，合成要50塊錢(qián)吧，等你拿到貨要2-3天時(shí)間吧，你摸條件需要消耗20大洋左右吧，結(jié)果還沒(méi)出來(lái)一周時(shí)間沒(méi)啦，就算你比較走運(yùn)p出來(lái)的是你的目的條帶，你也拿去車(chē)測(cè)序驗(yàn)證吧，片段太小還不能直接測(cè)序那需要做克隆吧200大洋有沒(méi)啦，測(cè)序費(fèi)需要25吧，合計(jì)一下：295，這是比較幸運(yùn)的有1%的可能。要不成功重頭再來(lái)一次，那就得花500多大洋啦。時(shí)間的損失呢老板可不會(huì)心疼你的。所以還直接扔給測(cè)序公司。。。。

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14樓2012-03-25 19:38:13

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