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[交流] 雙元表達(dá)載體農(nóng)桿菌EHA105

我想用農(nóng)桿菌EHA105構(gòu)建雙元表達(dá)載體，我手上現(xiàn)在有pcambia1301，和空的農(nóng)桿菌EHA105，是不是還需要一個(gè)帶有Vir基因的輔助質(zhì)粒。將1301和輔助質(zhì)粒一起轉(zhuǎn)到農(nóng)桿菌里？
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1樓 2011-05-25 20:27:08

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咸魚

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jhu132llh(金幣+5, EPI+1): 是滴，鼓勵(lì)積極幫助新蟲 2011-05-26 09:27:05

引用回帖:

Originally posted by 116093626 at 2011-05-25 20:27:08:
我想用農(nóng)桿菌EHA105構(gòu)建雙元表達(dá)載體，我手上現(xiàn)在有pcambia1301，和空的農(nóng)桿菌EHA105，是不是還需要一個(gè)帶有Vir基因的輔助質(zhì)粒。將1301和輔助質(zhì)粒一起轉(zhuǎn)到農(nóng)桿菌里？
多謝大家!

不需要，你需要將你的基因先克隆到一個(gè)有啟動(dòng)子的載體上，然后將啟動(dòng)子一起切下來(lái)連接到pCambia1301上，然后轉(zhuǎn)化EHA105即可。因?yàn)?301在多克隆位點(diǎn)前無(wú)啟動(dòng)子。

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Bella0224

2樓2011-05-25 21:01:14

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jhu132llh(金幣+3): 積極提問(wèn)交流獎(jiǎng) 2011-05-26 09:27:35

引用回帖:

Originally posted by 咸魚 at 2011-05-25 21:01:14:
不需要，你需要將你的基因先克隆到一個(gè)有啟動(dòng)子的載體上，然后將啟動(dòng)子一起切下來(lái)連接到pCambia1301上，然后轉(zhuǎn)化EHA105即可。因?yàn)?301在多克隆位點(diǎn)前無(wú)啟動(dòng)子。

雙元表達(dá)載體不是一個(gè)質(zhì)粒帶有t-dna 一個(gè)質(zhì)粒帶Vir基因么？1301上也沒(méi)有Vir基因呀

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3樓2011-05-25 21:27:45

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jinyuw

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jhu132llh(金幣+2): 鼓勵(lì)積極交流 2011-05-30 09:27:59

敢問(wèn)二樓的，農(nóng)桿菌EHA104和EHA105有和區(qū)別呀，我正在做EHA104的轉(zhuǎn)化。

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4樓2011-05-29 21:18:09

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Bella0224

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297353樓: Originally posted by 咸魚 at 2011-05-25 21:01:14
不需要，你需要將你的基因先克隆到一個(gè)有啟動(dòng)子的載體上，然后將啟動(dòng)子一起切下來(lái)連接到pCambia1301上，然后轉(zhuǎn)化EHA105即可。因?yàn)?301在多克隆位點(diǎn)前無(wú)啟動(dòng)子。...

我也在做利用農(nóng)桿菌的雙元表達(dá)載體，請(qǐng)問(wèn)這位蟲友，我是否也一樣要把我的目的基因克隆島一個(gè)含有啟動(dòng)子的載體上呢？這個(gè)載體怎么選擇呢？還是有常用的，還是都可以呢？

之后將啟動(dòng)子切下連接到我的另外含T-DNA的載體上，直接轉(zhuǎn)化進(jìn)入我的農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞就可以了么？

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5樓2013-03-13 17:02:20

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Bella0224

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298673樓: Originally posted by 116093626 at 2011-05-25 21:27:45
雙元表達(dá)載體不是一個(gè)質(zhì)粒帶有t-dna 一個(gè)質(zhì)粒帶Vir基因么？1301上也沒(méi)有Vir基因呀...

同問(wèn)。。。樓主我和你做的東西差不多，在構(gòu)建載體方面也好頭痛。。。。

我手里也有一個(gè)含t-DNA的載體，但是vir怎么辦？我好糊涂。。。。

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6樓2013-03-14 14:08:51

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XOooZzz

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2484603樓: Originally posted by Bella0224 at 2013-03-13 17:02:20
我也在做利用農(nóng)桿菌的雙元表達(dá)載體，請(qǐng)問(wèn)這位蟲友，我是否也一樣要把我的目的基因克隆島一個(gè)含有啟動(dòng)子的載體上呢？這個(gè)載體怎么選擇呢？還是有常用的，還是都可以呢？

之后將啟動(dòng)子切下連接到我的另外含T-DNA的 ...

朋友挖得一手好墳...
你的基因是要做什么用的呢？超表達(dá)？在特定組織表達(dá)？你的目標(biāo)植物是什么？
最普通的情況是，讓一個(gè)基因在擬南芥里面超表達(dá)。這樣直接改造常用的pCAMBIA1301就可以了，通過(guò)酶切連接的方法用這個(gè)基因的cds替換掉pCAMBIA1301的GUS編碼區(qū)，然后用這個(gè)改造后的載體轉(zhuǎn)化eha105，再用eha105轉(zhuǎn)擬南芥。
vir什么的不用管。eha105里面本身就有。

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7樓2013-03-14 17:13:53

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海尤希

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引用回帖:

2484940樓: Originally posted by XOooZzz at 2013-03-14 17:13:53
朋友挖得一手好墳...
你的基因是要做什么用的呢？超表達(dá)？在特定組織表達(dá)？你的目標(biāo)植物是什么？
最普通的情況是，讓一個(gè)基因在擬南芥里面超表達(dá)。這樣直接改造常用的pCAMBIA1301就可以了，通過(guò)酶切連接的方法用 ...

我的目標(biāo)植物是水稻，就是要將GFP整合上去，可以直接替換GUS，借用它的啟動(dòng)子嗎？還是說(shuō)要自己重新連接啟動(dòng)子然后連接到MCS？？

我被啟動(dòng)子搞暈了。。

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8樓2013-03-24 11:41:18

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引用回帖:

2487735樓: Originally posted by 海尤希 at 2013-03-24 11:41:18
我的目標(biāo)植物是水稻，就是要將GFP整合上去，可以直接替換GUS，借用它的啟動(dòng)子嗎？還是說(shuō)要自己重新連接啟動(dòng)子然后連接到MCS？？

我被啟動(dòng)子搞暈了。。...

自帶的35s啟動(dòng)子在水稻里也有活性。用玉米范素啟動(dòng)子也可以，據(jù)說(shuō)活性更強(qiáng)�？茨阕约旱膶�(shí)驗(yàn)要求了。

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9樓2013-03-24 13:55:45

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