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Lee_Py

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[求助] 想問(wèn)下在以cDNA為模板時(shí)，PCR的結(jié)果卻是徒步什么原因

用內(nèi)標(biāo)P的結(jié)果就很好說(shuō)明不是CDNA的問(wèn)題但是為啥用自己的引物卻P那么差 P的根marker一樣

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1樓 2011-06-02 12:56:32

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yabxxh

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【答案】應(yīng)助回帖

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amisking(金幣+2): 鼓勵(lì)應(yīng)助 2011-06-02 20:42:25

我最近做拼接PCR也是彌散帶，把所有的東西都換了一遍，鎖定引物和模版。我的模板質(zhì)粒非常異常，超螺旋的部分亮度太亮了。引物有一個(gè)也是用了好久的。
說(shuō)了半天，你的情況我覺(jué)得是cDNA濃度太高，或者你加的量過(guò)多了，不妨說(shuō)詳細(xì)點(diǎn)，大家研究研究

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2樓2011-06-02 15:29:51

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Lee_Py

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引用回帖:

Originally posted by yabxxh at 2011-06-02 15:29:51:
我最近做拼接PCR也是彌散帶，把所有的東西都換了一遍，鎖定引物和模版。我的模板質(zhì)粒非常異常，超螺旋的部分亮度太亮了。引物有一個(gè)也是用了好久的。
說(shuō)了半天，你的情況我覺(jué)得是cDNA濃度太高，或者你加的量過(guò)多 ...

嘿嘿首先感謝下但是我做了幾個(gè)梯度反轉(zhuǎn)的cDNA我分別稀釋了10倍、50倍、80倍、100倍但是條帶還是很彌散那幾個(gè)梯度P的結(jié)果都基本一樣稀釋的模板我也都是加1ul 50的體系

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3樓2011-06-02 17:07:38

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4樓2011-06-02 17:16:11

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【答案】應(yīng)助回帖

★ ★ ★
amisking(金幣+3): 鼓勵(lì)應(yīng)助 2011-06-02 20:42:33
Lee_Py(金幣+2): 2011-06-04 15:49:38

引用回帖:

Originally posted by Lee_Py at 2011-06-02 17:07:38:
嘿嘿首先感謝下但是我做了幾個(gè)梯度反轉(zhuǎn)的cDNA我分別稀釋了10倍、50倍、80倍、100倍但是條帶還是很彌散那幾個(gè)梯度P的結(jié)果都基本一樣稀釋的模板我也都是加1ul 50的體系

引物特異性不好吧。
我以前P側(cè)翼序列時(shí)。經(jīng)常P出彌散帶，就是真實(shí)PCR的反映。結(jié)果優(yōu)化后能P出單一條帶也是單引物自擴(kuò)結(jié)果。

如果你一定要優(yōu)化條件，可以用TOUCH DOWN。就是退火逐步降低。我的經(jīng)驗(yàn)是能篩到單一條帶。但不保證是你要的目的條帶。

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5樓2011-06-02 17:17:02

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amisking(金幣+3): 鼓勵(lì)應(yīng)助 2011-06-02 20:42:43
Lee_Py(金幣+3): 2011-06-04 15:49:46

LZ 的目的條帶多長(zhǎng)��？其實(shí)內(nèi)標(biāo)很好并不能說(shuō)明cDNA好啊，我這段時(shí)間做的用國(guó)產(chǎn)試劑盒反轉(zhuǎn)錄就能出actin但是目的條帶不出（目的條帶2100bp）,后來(lái)?yè)Q個(gè)進(jìn)口反轉(zhuǎn)錄試劑盒，一次目的條帶就出了，當(dāng)然actin也出。不知道LZ最后P出來(lái)目的條帶沒(méi)啊？
另外引物特異性問(wèn)題，LZ可以用NCBI上blast一下，看看非特異性擴(kuò)增多不多，如果不行就試一下改改引物。

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6樓2011-06-02 18:40:16

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